一种融合白蛋白纳米粒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种融合白蛋白纳米粒及其应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术利用基因工程技术表达融合白蛋白，并利用该融合白蛋白在中性水溶液中自组装载药，形成融合白蛋白纳米粒。本发明专利技术所研究出的融合白蛋白综合了靶向、pH和酶敏感官能团，利用此融合白蛋白制备得纳米粒具备靶向和可控释药的功能，该融合白蛋白纳米粒的制备方法简单易行，具有巨大的应用潜力。

A Fused Albumin Nanoparticles and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种融合白蛋白纳米粒及其应用
本专利技术涉及一种融合白蛋白纳米粒及其应用，属于生物医药

技术介绍
白蛋白为内源性物质，并且是一种不具有调理作用的蛋白。早期的研究发现，将其包覆于纳米粒或脂质体表面，可降低微粒对巨噬细胞的亲和力，从而延长循环时间，提高靶向性。结合了纳米粒载体和白蛋白性质两方面优势应运而生的白蛋白纳米粒载药系统近年来受到广泛关注。白蛋白纳米粒是以白蛋白作为载体，包封或吸附药物，经过固化分离形成的实心球体，具有生物相容性良好、毒性及刺激性低、无抗原性等多种优点。白蛋白纳米粒能够包裹的药物有抗肿瘤药、抗结核药、降血糖药、抗菌素等，目前最引人注目的应用还是将其作为抗肿瘤药物的载体，增加靶向性，减小毒副作用，提高疗效。由美国AbraxisBioScienceInc开发的紫杉醇人血清白蛋白纳米粒注射剂获得FDA批准上市，成为首个白蛋白纳米粒载药系统的成功案例。是将紫杉醇与人血清白蛋白结合，经静脉注射进入人体循环后，其很快分解成更小的白蛋白-紫杉醇复合物，利用天然白蛋白通路实现药物靶向并进入肿瘤细胞。主要是利用美国AmericanBioscienceInc.公开的一种独特的基于二硫键形成法的NabTM技术(nanoparticle.albuminboundtechnology，NabTM_technology)NabTM-技术是以白蛋白作为基质和稳定剂，在高剪切力(例如，超声处理、高压均化或类似方法)下，将包含水不溶性药物的油相和含白蛋白的水相混合，制备O/W乳剂，在没有任何常规表面活性剂或任何聚合物核心存在的情况下制备药物的白蛋白纳米粒的技术。然而，面临着一些不可避免的问题：首先，NabTM技术需要使用氯仿、二氯甲烷等有毒溶剂，且存在制备方法周期长及工艺繁琐等缺点；其次，白蛋白原料的获得受血液来源及提取污染的限制，且同一制备方法中，白蛋白的批间差异、白蛋白浓度、溶剂、温度、交联剂等会影响最终纳米制剂的性质；再次，是以非晶态、无定型状态存在，经静脉注射进人体循环后，纳米粒很快分解成更小的白蛋白-紫杉醇复合物，具有提前释药的风险。另外，目前上市白蛋白纳米粒的制备工艺较为复杂，需要高压均质以获得粒径合适、均一的纳米粒。
技术实现思路
为解决现有技术存在的上述缺陷，制备一种可控释药的载体，本专利技术通过重组蛋白技术制备可控释药型融合白蛋白纳米，并提供该融合白蛋白纳米在制备靶向药物方面的应用。本专利技术的第一个目的在于提供一种融合白蛋白纳米粒，所述融合白蛋白纳米粒是将RGD、白蛋白(HSA)、基质金属蛋白酶(MMP)和6～18个组氨酸依次连接，融合表达；所述RGD、白蛋白和基质金属蛋白酶通过连接肽连接。在本专利技术的一种实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列是DDDDK。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述连接肽的核苷酸序列是gatgatgatgataag。在本专利技术的一种实施方式中，所述白蛋白是人血清蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述融合白蛋白含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供编码所述融合白蛋白的基因。本专利技术的第三个目的是提供表达所述融合白蛋白的细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞包括细菌细胞或真菌细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞为酵母细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述酵母为毕赤酵母SMD1168H。本专利技术的第四个目的是提供一种制备可控释药型融合白蛋白纳米载体的方法，所述方法是将编码所述融合白蛋白的基因与载体连接，转化至毕赤酵母细胞中。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体是pPICZαA。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体上连接信号肽α－factor。在本专利技术的一种实施方式中，所述融合白蛋白纳米载体是以毕赤酵母SMD1168H为宿主，以pPICZαA为载体表达的如SEQIDNO.1所示的融合白蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将表达了所述融合白蛋白的毕赤酵母发酵，收集发酵液，提取蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还对提取的蛋白进行纯化。本专利技术的第五个目的是提供所述方法制备的可控释药型融合白蛋白纳米载体在装载药物方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是用pH响应自组装技术装载药物。在本专利技术的一种实施方式中，所述药物包括但不限于紫杉醇、多西他赛、阿霉素。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是装载siRNA。在本专利技术的一种实施方式中，所述装载是将所述白蛋白与药物以1:2的比例在pH为5～6的条件下混合，而后pH调节至7～8。在本专利技术的一种实施方式中，所述装载是将所述白蛋白与药物以1:2比例在pH为5.5的条件下混合，而后pH调节至7.4。本专利技术的第六个目的是提供应用所述可控释药型融合白蛋白纳米载体包载的药物。本专利技术还要求保护所述融合白蛋白在制备预防或治疗肝癌，胃癌，肺癌、乳腺癌、宫颈癌等抗癌的药物中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述药物作用对象包括但不限于HepG2,MGC-803,A549,MCF-7，HeLa细胞。有益效果：本专利技术利用基因工程技术表达一系列白蛋白融合蛋白(RGD-link-HSA-link-MMP-His)，该融合白蛋白在可自组装载药形成白蛋白融合蛋白纳米粒。首先，重组蛋白技术可以使细胞本身变成“批量生产药物的工厂”，确保白蛋白来源的安全可靠；其次本专利技术所研究出的融合白蛋白综合了靶向、pH和酶敏感官能团，利用此融合白蛋白制备得纳米粒具备靶向和可控释药的功能，且制备融合白蛋白纳米粒的方法简单易行，适合工业化应用。附图说明图1(A)各融合基因序列及命名；(B)构建的pPICZαA-RGD-HSA-MMP-His载体，目的基因插入在XhoI和NotI之间；(C)融合PCR后扩增获得的各基因序列的核酸凝胶电泳图；(D)各组白蛋白融合蛋白的WesternBlot分析，从上到下分别为HSA，His，RGD特异性分析；(E)RHMH18的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分子量测定结果。图2为各载药白蛋白融合蛋白纳米粒子透射电镜图。图3为各载药白蛋白融合蛋白纳米粒子对代表性细胞的毒性及细胞对粒子的摄取情况：(A)各载药白蛋白融合蛋白纳米粒子对正常细胞293的毒性测试结果；(B)各载药白蛋白融合蛋白纳米粒子对癌细胞HepG2的毒性测试结果；(C)各载药白蛋白融合蛋白纳米粒子对癌细胞MGC-803的毒性测试结果；(D)癌细胞HepG2对最终纳米粒子(RHMH18)的摄取情况。具体实施方式毕赤酵母(Pichiapastoris)表达菌株SMD1168H、大肠杆菌菌株DH5α为本实验室保存。YPD液体(发酵)培养基：1％(w/w)酵母粉，2％(w/w)蛋白胨，2％(w/w)葡萄糖。YPD固体(平板)培养基：1％(w/w)酵母粉，2％(w/w)蛋白胨，2％(w/w)葡萄糖，1％(w/w)琼脂。含有机碳源甘油的培养基BMGY：1％(w/w)酵母粉，2％(w/w)蛋白胨，1％(v/v)甘油，KPB缓冲液(磷酸钾盐)100mmol，10％(v/v)YNB10×；含无机碳源甲醇的培养基BMMY：1％(w/w)酵母粉，2％(w/w)蛋白胨，0.5％(v/v)甲醇，KPB缓冲液(磷酸钾盐)100mmol，10％(v/v)YNB10×；LB液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，依次含有RGD、白蛋白、基质金属蛋白酶和6～18个组氨酸；所述RGD、白蛋白和基质金属蛋白酶通过连接肽连接。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，依次含有RGD、白蛋白、基质金属蛋白酶和6～18个组氨酸；所述RGD、白蛋白和基质金属蛋白酶通过连接肽连接。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列含有DDDDK；所述白蛋白是人血清蛋白。3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因。4.表达权利要求1或2所述融合蛋白的细胞。5.一种制备可控释药型融合白蛋白纳米载体的方法，其特征在于，所述方法是将编码所述融合白蛋白的基因与载体连接，转化至毕赤酵母细胞中。6.一种药物组合物，其特征在于，应用权利要求1或2所述的融合白蛋白装载药物。7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敬华，周娟，王明宇，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32