溶瘤病毒和治疗分子制造技术

本发明专利技术涉及一种编码胞苷脱氨酶(CDA酶)多肽的溶瘤病毒、包含其的组合物、以及用于预防或治疗目的的应用，更具体地癌症的治疗。本发明专利技术还提供治疗疾病或病理状况的方法，包括施用该溶瘤病毒或其组合物，和制备该溶瘤病毒的方法。

Oncolytic Viruses and Therapeutic Molecules

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】溶瘤病毒和治疗分子
本专利技术属于溶瘤病毒和治疗基因领域。本专利技术提供了包含一种或多种治疗基因的溶瘤病毒。更确切地说，本专利技术的治疗基因是核苷库调节剂。更具体地，本专利技术的核苷库调节剂是胞苷脱氨酶或具有胞苷脱氨酶活性。溶瘤病毒与本文定义的一种或多种治疗基因的组合赋予溶瘤病毒增强的抗肿瘤功效。本专利技术最后提供了用于预防和/或治疗增殖性疾病的溶瘤病毒。
技术介绍
溶瘤病毒是一类具有肿瘤依赖性自永续性(self-perpetuation)独特性质的治疗剂(Hermiston等，2006，Curr.Opin.Mol.Ther.，8(4)：322-30)。使用这些病毒的好处是，随着它们复制，它们裂解宿主细胞。溶瘤病毒能够在分裂细胞(例如，癌细胞)中选择性复制，同时非分裂细胞(例如，正常细胞)不受伤害。随着被感染的分裂细胞因裂解而被破坏，这些细胞释放出新的感染性颗粒，可以感染周围的分裂细胞。因此，溶瘤病毒提供了用于治疗癌症的新领域，任选结合癌症的常规治疗(Fisher等，2006，Curr.Opin.Mol.Ther.，8(4)：301-13)。癌细胞是许多病毒的理想宿主，因为它们具有失活的抗病毒干扰素途径或具有突变的肿瘤抑制基因，其使得病毒复制能够不受阻碍地进行(Chernajovsky等，2006，BMJ，332(7534)：170-2)。包括腺病毒、呼肠弧病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒和痘苗病毒在内的几种病毒现已作为溶瘤剂在临床上进行测试。一些病毒天然是溶瘤的，并且具有选择性感染和杀死肿瘤细胞的先天能力。然而，也可以通过修饰天然存在的病毒，将溶瘤病毒工程化。为此，目前用于修饰病毒的主要策略包括：病毒基因的功能性缺失、使用肿瘤-或组织-特异性启动子来控制这些病毒基因的表达、用于将病毒重定向到癌细胞表面的向性修饰，以及许多其他可能方案。在天然溶瘤病毒中，痘苗病毒(痘病毒科)具有许多用于溶瘤病毒疗法中的理想病毒骨架所必需的关键属性。这些包括生命周期短、细胞到细胞的扩散快、溶解能力强、克隆能力强以及分子生物学定义明确。此外，尽管能够在人细胞中复制，但这些病毒被认为不构成天然的健康问题，并且得到尤其充分的表征，在根除天花的斗争期间已被传递给数百万人。使用疫苗株或基因修饰的痘苗株的早期临床结果已经证明了抗肿瘤作用(Thorne等，2005，Curr.Opin.Mol.Ther.，7(4)：359-65)。可以实施病毒的病毒修饰以增强病毒能力，以感染和裂解100％肿瘤细胞，这在体内环境中是难以实现的。因此，溶瘤病毒通常用酶-前药系统“武装”，其通过发挥强烈的旁观者效应来增强病毒治疗的溶瘤功效，从而允许消除相邻的未受感染的肿瘤细胞。例如，具有所谓的FCU1自杀基因的武器，所述基因编码结合了FCY1和FUR1的酶活性的双功能嵌合蛋白，可以有效地催化5-氟胞嘧啶(5-FC)(一种无毒的抗真菌剂)直接转化成毒性代谢产物5-氟尿嘧啶(5-FU)和5-氟尿嘧啶-5'单磷酸盐(5-FUMP)，从而绕过某些人肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的天然抗性(Erbs等，2000，CancerRes.，60(14)：3813-22)。病毒修饰也可以用于增加安全性。在这方面，与野生型病毒相比，胸苷激酶(TK)缺失的病毒显示出具有降低的致病性，但保留了在肿瘤细胞中的复制(Buller等，1985，Nature，317(6040)：813-5)。Foloppe等证明，在人结肠肿瘤的小鼠模型中，表达FCU1基因的TK基因缺失的VACV在体外和体内均具有有效的抗肿瘤作用(Foloppe等，2008，GeneTher.，15：1361-71)。显然，迫切需要开发治疗癌症的有效方法。已经研发了用于治疗和诊断应用的减毒溶瘤病毒株，并且正在临床研究中进行评估。然而，使溶瘤病毒减毒的方法导致其功效降低。从治疗的角度来看，这种疗效的降低可导致整体应答减少、患者存活率降低、死亡率增加、病理耐药性......因此，需要新的安全的应当更有效的溶瘤病毒。在本专利技术的内容中，专利技术人已经测试了包含一种或多种治疗基因的溶瘤病毒。更具体地，治疗基因是核苷脱氨酶。甚至更特别地，治疗基因是胞苷脱氨酶。胞苷脱氨酶(CDAse)-也称为脱氧胞苷脱氨酶或胞苷氨基水解酶-是参与嘧啶补救途径的核苷库调节剂(nucleosidepoolmodulator)，并且因此参与脱氧核糖核苷酸(dNTP)的平衡。dNTP的适当平衡对于DNA复制的忠实性是必不可少的。事实上，dNTP池平衡的调节看起来对DNA完整性、基因组稳定性有影响，并且可导致遗传毒性损害。核基因组的两条DNA链处于由这种dNTP池不平衡引起的相似突变风险中，即使两种主要的复制错误纠正机制在遗传上完整时，这种风险也不会被完全抑制。(Buckland等，2014年12月，PLoSGenet.，10(12)：e1004846)。虽然已知dNTP的减少或不平衡会导致遗传毒性和增加的诱变，但dNTP的增加常常会导致忠实性降低的不受控DNA复制，从而可能促进癌症发展(Kohnken等，2015，Mol.Cancer；14：176)。靶向dNTP合成和代谢的治疗剂可用于几种类型的癌症的治疗。尽管进行了数项研究，但尚未完全了解调节胞内dNTP水平和维持其体内平衡的分子机制。(Kohnken等，2015，Mol.Cancer；14：176)。据报道，CDA酶缺陷导致过量的脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。由于基础聚-ADP-核糖聚合酶1(PARP-1)活性的部分抑制，CDA酶缺陷细胞中的DNA复制是不成功的。实际上，dCTP的胞内积累抑制PARP-1活性，损害检查点激酶1的激活和下游检查点的功效，从而允许随后在有丝分裂中累积未复制的DNA。这种未复制的DNA导致在“难以复制”的位点(如，着丝粒和脆性位点)处姐妹染色单体之间形成超细后期桥(UFB)。(Gemble等，2015，PLoSGenet，11(7)e1005384)已知CDA酶具有抗病毒作用。APOBEC3G是一种使复合胞苷脱氨基的CDA酶，是一种先天防御蛋白，显示出对抗逆转录病毒和逆转录转座子的活性(Oliva等，2016，Immunol.Cell.Biol.94：689-700)。首先针对HIV-1描述了APOBEC3蛋白在抑制病毒感染中的作用。然而，许多研究也显示出APOBEC3作用于与人类疾病相关的其他病毒的证据，所述其他病毒包括HTLV、HCV、HBV、HPV、HSV-1和EBV。APOBEC3G通过一系列编辑依赖性和非依赖性的机制来抑制这些病毒。许多病毒已经进化出抵抗APOBEC作用的机制，并且增强APOBEC3活性的策略构成了抗病毒药物开发的新方法。(Vieira等，2013，Biomed.Res.Int.，2013：ID683095)。据报道，APOBEC是针对多种含DNA病毒的限制因子(Moris等，2014，FrontMicrobiol，5：534)。然而，已经表明APOBEC3家族成员不是痘苗病毒(一种痘病毒)复制的限制因子，并且痘苗病毒不能降解APOBEC3G(Kremer等，2006，Virol.J.，3：86)。据报道，APOBEC基因在非小细胞肺癌中过表达。APOBEC3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶瘤病毒，其包含编码胞苷脱氨酶(CDA酶)多肽的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.28 EP 16306831.51.一种溶瘤病毒，其包含编码胞苷脱氨酶(CDA酶)多肽的核苷酸序列。2.权利要求1的溶瘤病毒，其中所述CDA酶多肽选自CDA、CDD、EC3.5.4.5、APOBEC、AID和胞苷脱氨酶样蛋白。3.权利要求2的溶瘤病毒，其中所述APOBEC选自APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H和APOBEC4，并且优选其中所述APOBEC是APOBEC2。4.权利要求1或2的溶瘤病毒，其中所述CDA酶是酵母胞苷脱氨酶(CDD1)或人胞苷脱氨酶(hCD)。5.权利要求4的溶瘤病毒，其中所述CDD1包含与SEQIDNO:1具有至少80％，优选高于90％，且更优选高于95％同一性的氨基酸序列。6.权利要求4的溶瘤病毒，其中所述hCD包含与SEQIDNO:2具有至少80％，优选高于90％，且更优选高于95％同一性的氨基酸序列。7.权利要求3的溶瘤病毒，其中所述APOBEC2包含与SEQIDNO:3具有至少80％，优选高于90％，且更优选高于95％同一性的氨基酸序列。8.权利要求1至7任一项的溶瘤病毒，其中所述CDA酶多肽催化基于胞苷的组分脱氨为基于尿苷的组分，如胞苷至尿苷和脱氧胞苷(dC)至脱氧尿苷(dU)。9.权利要求8的溶瘤病毒，其中所述基于胞苷的组分是游离的或复合的。10.权利要求1至9任一项的溶瘤病毒，其中所述病毒选自痘病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、呼肠弧病毒、塞内卡谷病毒(SVV)、水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、morbillivirus、逆转录病毒、腺病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、α病毒、慢病毒、流感病毒、Sinbis病毒、粘液瘤病毒、弹状病毒、小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒、细小病毒等。11.权利要求10的溶瘤病毒，其中所述痘病毒是属于正痘病毒属的痘病毒。12.权利要求11的溶瘤病毒，其中所述痘病毒属于痘苗病毒(VV)种或牛痘病毒种。13.权利要求12的溶瘤病毒，其中所述痘苗病毒选自Copenhagen、Wyeth和WesternReserve(WR)。14.权利要求10至13任一项的溶瘤病毒，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·厄博斯，J·弗洛派，
申请(专利权)人：特朗斯吉有限公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR