一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法技术

本发明专利技术公开了一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，属于基因工程领域，主要包括：构建CRISPR/Cas9‑SIP1基因敲除载体，通过农杆菌转化目的玉米获得SIP1基因敲除的玉米植株。该基因工程方法通过干预SIP1对主基因ZmSBEII参与的淀粉分支作用，提升玉米籽粒中直链淀粉的含量。该方法的实现对利用ZmSBEII互作蛋白开发高直链淀粉玉米新品种具有重要的实践指导意义。

An Experimental Method of Improving Amylose Content in Maize by Knocking out SIP1 Gene

【技术实现步骤摘要】
一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法
本专利技术涉及的是基因工程
，尤其涉及的是一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法。
技术介绍
淀粉是玉米籽粒的重要组成部分，约占籽粒总重量的70％。淀粉根据结构差异，可分为直链淀粉和支链淀粉两种，前者由α-1，4糖苷键连接而成，为线性多聚糖；后者由α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键连接而成，是具有分支的多聚糖。在普通玉淀粉中，直链淀粉约占淀粉总量的27％，其余为支链淀粉。高直链玉米淀粉是指直链淀粉含量超过50％的玉米淀粉，这种淀粉在工业上有广泛的利用价值。在食品工业中，高直链淀粉被广泛运用于生产减肥食品、煎炸食品及保健食品。在非食品工业中，高直链淀粉除了在制药、建筑、石油开采、造纸、纺织、粘合剂等领域发挥着不可替代的作用外，还被用于生产可降解塑料。利用高直链玉米淀粉生产的光解塑料膜在自然条件下很容易被降解，是解决目前日益严重的“白色污染”的有效途径。随着人类对淀粉认识的进一步加深和技术的不断进步，高直链淀粉作为一种无公害的工业原料被高度重视，这也是近年来高直链淀粉生物合成机制成为研究热点的重要原因。进入21世纪以后，对于植物淀粉生物合成机制，特别是对淀粉生物合成核心酶的认识有了很大的突破，同时各种植物，特别是单子叶植物的遗传转化体系的相继建立，使得利用基因工程手段来改良淀粉品质成为可能。国际上的高直链淀粉玉米品种就是源于内源淀粉生物合成核心酶ZmSBEIIb（StarchbranchingenzymeIIb）受到抑制后，玉米籽粒中直链淀粉的含量有了较大的提高。国际专利WO9722703A2报道了反义抑制内源ZmSBEIIb基因能使转基因玉米淀粉粒中较长葡聚糖链增加两倍。这一专利显示出SBEIIb在改良淀粉品质方面的巨大潜力，但是由于SBEIIb同时也是淀粉生物合成的核心酶，抑制SBEIIb基因虽然可以显著提高直链淀粉的含量，但它同时引起籽粒总淀粉含量的下降和含水量的增加，高直链淀粉玉米杂交种的平均产量只有普通玉米的65-75%。虽然淀粉分支酶在淀粉代谢中的基本生理功能已研究的非常清楚，但是关于该蛋白在高直链淀粉形成中的分子机制及其调控机理的知识仍相当缺乏。本项研究在利用一系列的候选实验技术鉴定出SIP1是SBEIIb的可能互作调控因子的基础上，利用CRISPR/Cas9系统敲除玉米的SIP1基因，有效提升了玉米籽粒直链淀粉的含量，将为利用基因工程手段改良玉米淀粉品质提供重要的实践指导意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术不足，提供了一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，包括：构建CRISPR/Cas9-SIP1基因敲除载体，通过农杆菌转化目的玉米获得SIP1基因敲除的玉米植株。所述的SIP1基因敲除转基因玉米的直链淀粉含量高于非转化植株。所述的SIP1基因敲除CRISPR/Cas9载体中的sgRNA对应核苷酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2。其中sgRNA启动子为OsU3，Cas9蛋白的启动子为加强型玉米Ubi启动子，卡那霉素抗性基因的启动子为CaMV35S。所述的农杆菌为LBA4404。进一步地，采用基因编辑的方法将目的特种玉米中的SIP1基因敲除，包括以下步骤：用CRISPR/Cas9的方法将目的玉米中的两条SIP1基因敲除，包括以下步骤：根据SIP1基因序列确定sgRNA靶向序列（SEQIDNO.1和SEQIDNO.2）；以sgRNA靶向序列的多聚寡核苷酸为基础，在正义链的5'加A，反义链的5'加T；将正义、反义多聚寡核苷酸双链退火形成二聚体后与改造的CRISPR/Cas9载体相连构建真核表达重组质粒；将构建的CRISPR/Cas9质粒在细菌中扩增后转入农杆菌LBA4404；利用农杆菌将CRISPR/Cas9质粒（混合分别带SEQIDNO.1和SEQIDNO.2序列的两种CRISPR/Cas9质粒）导入普通玉米，筛选获得SIP1基因沉默的转基因植株。本专利技术在利用一系列的候选实验技术鉴定出SIP1是SBEIIb的可能互作调控因子的基础上，利用CRISPR/Cas9系统敲除玉米的SIP1基因，有效提升了玉米籽粒直链淀粉的含量，将为利用基因工程手段改良玉米淀粉品质提供重要的实践指导意义。附图说明图1为CRISPR/Cas9载体图谱。图2为转基因玉米SIP1基因PCR鉴定图。A为检测SEQIDNO.1靶向序列，B为检测SEQIDNO.2靶向序列的电泳图。图3为转基因和对照组玉米籽粒重量（图3A）及直链淀粉含量比例柱状图（图3B）。具体实施方式具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1。一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，包括以下步骤。（1）酵母双杂交筛选SIP1与ZmSBEIIb的相互作用。实验采用BD公司的的Libraryconstruction&Screeningkits试剂盒，文库构建的总RNA分离于高直链玉米Hamyae20DAP的籽粒。本系统以质粒pGBKT7作为DB载体，以pGADT7为AD载体，利用2个报告基因(HIS3和ADE2)筛选与ZmSBEIIb互作的蛋白，经筛选，发现SIP1是ZmSBEIIb的互作蛋白。经ZmSBEIIb互作候选基因回转检测及β-半乳糖苷酶活性测试，初步认定SIP1与ZmSBEIIb存在蛋白互作可能。（2）SIP1SgRNA靶向序列设计。下载SIP1（GenBankaccessionnumber:FJ766095）基因序列，在MaizeGDB数据库中与B104玉米品系的基因比对后发现有两个基因：Zm00001d011685和Zm00001d043703。针对这两个转录本，使用在线SgRNA靶向序列设计工具（https://zlab.bio/guide-design-resources）设计SgRNA序列分别如下：GCTCTCCCCAGGGTCCCCAT（T1），TGCTTCCGCTACTTGATATA（T2）。合成DNA双链的同时在序列两段加BstNI（CC^AGG）酶切位点。（3）CRISPR/Cas9质粒构建。合成T1的Forwardoligo：AGCTCTCCCCAGGGTCCCCAT和Reverseoligo：TATGGGGACCCTGGGGAGAGC。合成T2的Forwardoligo：ATGCTTCCGCTACTTGATATA和Reverseoligo：TTATATCAAGTAGCGGAAGCA。在10μl体系中加入100μM两条oligo各1μl，使用PCR仪加热至95℃，5min，缓慢降温至室温1hr，1:200稀释T1和T2的二聚体备用。依据BstNI酶切使用说明书，用10μl体系（NEBuffer™2.1）酶切CRISPR/Cas9质粒（图1）2μg，60℃孵育1hr。胶回收质粒片段-20℃保存备用。使用T4DNA连接酶，将2μl质粒和6μl二聚体16℃连接过夜，取连接产物2μl，转化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，其特征在于，包括：构建CRISPR/Cas9‑SIP1基因敲除载体，通过农杆菌转化目的玉米获得SIP1基因敲除的玉米植株。

【技术特征摘要】
1.一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，其特征在于，包括：构建CRISPR/Cas9-SIP1基因敲除载体，通过农杆菌转化目的玉米获得SIP1基因敲除的玉米植株。2.根据权利要求1所述的一种敲除SIP1基因提升玉米直链淀粉含量的实验方法，其特征在于，所述的SIP1基因敲除转基因玉米的直链淀粉含量高于非转化植株；所述的SIP1基因敲除CRISPR/Cas9载体中的sgRNA对应核苷酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2，其中sgRNA启动子为OsU3，Cas9蛋白的启动子为加强型玉米Ubi启动子，卡那霉素抗性基因的启动子为CaMV35S；所述的农杆菌为LBA4404。3.根据权利要求1所述的一种敲除SIP1基因提升...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈超，任郭子君，黄瑞鹏，
申请(专利权)人：陈超，
类型：发明
国别省市：广东,44