一株低温高产酸乳酸菌制造技术

一株低温高产酸乳酸菌，涉及一种乳酸菌。本发明专利技术低温高产酸乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15833。本发明专利技术低温高产酸乳酸菌，适合北方低温秸秆微贮发酵条件且产酸量高，为高纬度、寒冷地区的秸秆微贮发酵的发展提供了良好的菌种资源。

A Low Temperature and High Acid-Producing Lactic Acid Bacteria

【技术实现步骤摘要】
一株低温高产酸乳酸菌
本专利技术涉及一种乳酸菌。
技术介绍
仅在黑龙江省，每年便会产生约为4千万吨的玉米秸秆，但当地农民却不能有效地利用秸秆，玉米秸秆的处理方式多为焚烧或随意丢弃，且这种处理方式会造成严重的环境污染(如雾霾的频发)和资源浪费。与此同时，黑龙江还是畜牧大省，仅牛就有约5百万头，但饲料化的秸秆量不仅不足，且质量不优。很多事实表明，玉米秸秆用微贮发酵的方法发酵后，会变成一种含有酸香气味、牲畜爱食且易消化的粗饲料。这样的处理方法，在一定程度上不仅解决了上述问题，而且还会带来巨大的经济效益。而乳酸菌在微贮发酵的过程中，有很重要的作用，会直接影响微贮饲料制备的好坏。由于玉米秸秆自身所携带的乳酸菌数量较少，无法在微贮发酵过程中发挥作用，会严重影响微贮饲料的制备，因此需要额外添加乳酸菌才能保证生产出高品质的微贮饲料。目前市售的微贮乳酸菌添加剂是常温乳酸菌，其最适生长温度一般都高于15℃，当气温低于此温度时，就会生长代谢迟缓，导致发酵延迟、甚至停滞，不适于黑龙江省玉米秸秆微贮饲料制备时的环境温度。而大面积修建发酵车间或提供持续供暖系统投入量大，不符合实际发展现状。因此，获得适应北方低温发酵条件的乳酸菌具有积极意义。
技术实现思路
本专利技术提供了一株低温高产酸乳酸菌，适合北方低温秸秆微贮发酵条件且产酸量高。本专利技术低温高产酸乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15833。本专利技术屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518为革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性，菌落形态为白色、有隆起、不透明、表面湿滑、菌落边缘规则，菌株形态为圆形、单个或成对排列(如图2所示)。本专利技术屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518在15℃条件下、发酵初期，便可将pH值迅速下降至5.00左右，而且产酸量明显优于市售乳酸菌，特别是发酵24h总酸度。本专利技术屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518可在NaCl浓度为0.16g/ml条件下生长。本专利技术为高纬度、寒冷地区的秸秆微贮发酵的发展提供了良好的菌种资源。屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518为屎肠球菌，属于肠球菌属(Enterococcus)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.15833，保藏日期为2018年05月31日。附图说明图1是15℃环境下屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518和“KP”菌株72h内总酸度变化图。图2是屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518的电子显微镜观察图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式低温高产酸乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.15833。本实施方式屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518分离自由内蒙古乌兰浩特市的八一牧场、园中园牧场和洪喜牧场苜蓿剪碎压实常温青贮发酵的青贮窖中。筛选过程；从内蒙古乌兰浩特市的八一牧场、园中园牧场和洪喜牧场购得苜蓿，将其剪碎压实，在1000吨的青贮窖中进行常温青贮发酵。在腐熟中后期，随机取回少量的青贮样品，用真空密封机塑封，保证厌氧环境，并置于冰盒中低温保存备用。将低温保存的青贮饲料在2～3h内进行缓冻，随后分别进行以下操作：用电子天平随机称取5g样品，加入装有100mL无菌生理盐水的试剂瓶中，摇晃30s；在无菌条件下，采用10倍梯度稀释法，将青贮饲料的滤液稀释至103、104、105倍；用移液枪分别移取稀释了103、104、105倍的青贮饲料滤液各1mL，涂布到含有0.5％CaCO3的MRS固体培养基上，15℃下培养72h，观察菌落的生长情况。在无菌条件下挑取所有培养基上，最先长出且周围出现较大溶钙圈的菌落，采用平板划线法获得单菌落，再将分离出的、具有典型乳酸菌性状的菌种转移到含有0.5％CaCO3的MRS固体培养基上，15℃下培养72h，多次重复这一过程。选择生长状况良好的菌株，对其进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验，将革兰氏染色呈阳性反应、过氧化氢酶试验呈阴性反应且最先长出、溶钙圈大的菌株转接到MRS斜面固体培养基上保存备用。复筛：在无菌条件下，将初步筛选的菌株与作为对照的“KP”菌株分别取1接种环，置于灭过菌的MRS液体培养基中，摇晃混匀，并用封口膜以及皮筋密封瓶口，形成厌氧环境，随后置于恒温培养箱中，并设置温度参数为15℃进行培养，定期(每隔24h)检测产酸情况，用酸度计测定72h内其pH值和酸度变化，选择产酸量最大的菌株，并命名为“Ef0518”。MRS培养基的配方如表所示：表1上述“KP”菌株为黑龙江科蓬生物科技有限公司市售的乳酸菌冻干粉制剂用30℃左右的蒸馏水进行活化，随后无菌条件下，对其进行多次转接培养，最后选取生长状况良好的菌株，转接到MRS斜面固体培养基中备用。Ef0518为革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性，菌落形态为白色、有隆起、不透明、表面湿滑、菌落边缘规则，菌株形态为圆形、单个或成对排列。在15℃条件下，“Ef0518”菌株和“KP”菌株的pH整体都呈下降趋势；“Ef0518”菌株的pH变化明显，在72h内由6.89下降到5.28；相比之下，作为对照的“KP”菌株，其pH下降趋势略趋于平缓，在72h内，pH仅由7.06下降到6.87。在15℃条件下，“Ef0518”菌株和“KP”菌株的总酸度总体上都平稳增长(如图1所示)，“Ef0518”菌株的总酸度明显比对照“KP”菌株的总酸度值大，通过计算可知，“Ef0518”菌株在24h、48h、72h时的总酸度整体都比对照的“KP”菌株提高了50％以上，且在24h时，其总酸度提高最高，为95％。鉴定：将菌株“Ef0518”送往广州艾基生物技术有限公司进行16SrDNA测序，Ef0518”菌株的16SrDNA序列总长度为1392bp，经过BLAST对比分析，“Ef0518”的16SrDNA序列与肠球菌属(Enterococcus)中的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、耐久肠球菌(Enterococcusdurans)的序列相似性最高，故可确定“Ef0518”为肠球菌属(Enterococcus)。结合生理生化检测结果(如表2所示)，参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》确定“Ef0518”为肠球菌属(Enterococcus)中的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。表2实施例1培养基低温产酸对比试验：将屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef0518、屎肠球菌B5-2(“优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响”，《草业学报》，2016年4月)以及“KP”菌株(黑龙江科蓬生物科技有限公司市售的乳酸菌冻干粉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株低温高产酸乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcus faecium)Ef0518，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15833。

【技术特征摘要】
1.一株低温高产酸乳酸菌，其为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)Ef051...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷博，曹亚彬，孙晓波，原韬，安琦，牛彦波，吴皓琼，耿贵，何鑫，徐丹丹，莫廷利，张志宏，戴长青，吴忠伟，王书功，隋立涛，
申请(专利权)人：黑龙江省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23