抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79-01及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及应用。一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79‑01，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合。本发明专利技术的优点在于提供了一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的H7N9禽流感样本进行定性诊断，而且可以快速便捷的进行检测。

Monoclonal Antibody ZJU79-01 Against Hemagglutinin Protein of Avian Influenza Virus H7N9 and Its Application

【技术实现步骤摘要】
抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79-01及其应用
本专利技术属于生物
，涉及抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-01，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。
技术介绍
新型H7N9禽流感于2013年3月底在中国上海和安徽率先发现，到目前为止，H7N9禽流感在中国已出现5波疫情，并且在加拿大、马来西亚和澳大利亚也有人感染H7N9的报道。值得令人注意的是，从2016年10月开始的第五波H7N9疫情中观察到感染人数急剧增加，感染范围向西部省份蔓延，以及出现人感染高致病性H7N9禽流感病例。H7N9禽流感对人的致病性强和死亡率高，感染者有一半以上会发生重症肺炎，且死亡率高达30％以上。其次，该病毒对家禽致病性弱，家禽患病不易被发现，从而不能做到对人的及时防护处理。目前治疗H7N9禽流感方法主要是神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦)。而早期治疗成为关键，在症状出现超过5天后才开始抗病毒治疗时，死亡风险增加。因此，快速而准确的诊断对降低病死率至关重要。目前H7N9感染的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法，如逆转录酶聚合酶链反应和实时定量聚合酶链反应。但是上述方法都需要特殊设备和条件，对于某些条件落后的地区并不适合。因而开发一种快速、灵敏、廉价的H7N9病毒检测产品势在必行，这能促进更早更广泛的发现H7N9感染，减少重症病例发生，降低病死率。综上所述，开发H7N9禽流感病毒单克隆抗体，用于快速灵敏检测方法的建立迫在眉睫。基于以上背景，本项目选定血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立新型的H7N9禽流感病毒病诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。本专利技术用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。
技术实现思路
为了解决以上问题，本专利技术提供了一种可以快速灵敏检测病毒的抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体。本专利技术的目的是提供一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，能识别H7N9禽流感病毒。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJU79-01，能特异性识别禽流感病毒的血凝素蛋白。一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79-01，抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.2(DNA序列如SEQIDNo.1)，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.4(DNA序列如SEQIDNo.3)所示，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合。SEQIDNo.1Heavychain:DNAsequence(417bp)Signalsequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4ATGAAATGCAGCTGGGTCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAGCTTTAAAGACTACTTTATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGTTGGATTGATCCTGAAAAAGATAATACTATGTATGACCCGAAATTCCAGGACAAGGCCAGTATTACAACAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCATCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGGGGGGCTACGGTCTATTACTATACTCTGGACTACTGGGGTCAGGGAACATCAGTCGCCGTCTCCTCASEQIDNo.2Heavychain:Aminoacidsequence(139AA)Signalpeptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4MKCSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFSFKDYFMHWVRQRPEQGLEWIGWIDPEKDNTMYDPKFQDKASITTDTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCARGATVYYYTLDYWGQGTSVAVSSSEQIDNo.3Lightchain:DNAsequence(381bp)Signalsequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4ATGGAGTCTCATACTCAGGCCTTTGTATTCGCGCTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGTGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGTTACTACTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGGCATCCAATCGATACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCCCTGTACAGTCTGAAGACCTGGCAGATTATTTCTGCCAGCAATATACCAGCTATCCTCTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAGASEQIDNo.4Lightchain:Aminoacidsequence(127AA)Signalpeptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4MESHTQAFVFALLWLSGVDGDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVVTTVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISPVQSEDLADYFCQQYTSYPLTFGGGTKLEIR所述单克隆抗体由杂交瘤细胞产生。所述杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJU79-01，能稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-01。本专利技术的第二个目的提供抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：(1)动物的免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H7N9禽流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行免疫。血凝素蛋白由H7N9禽流感病毒减毒株接种鸡胚，培养并收获病毒液，经甲醛灭活、纯化、裂解及再纯化等方法，以磷酸缓冲液稀释制备获得。(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79‑01，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合。

【技术特征摘要】
1.一种抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU79-01，抗体的重链氨基酸序列如SEQIDNo.2，轻链氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体ZJU79-01，其特征在于：所述单克隆抗体由杂交瘤细胞产生。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体ZJU79-01，其特征在于：所述杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJU79-01，能稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-01。4.权利要求1所述的抗H7N9禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU79-01的制备方法，其特征在于：该单克隆抗体通过的以下步骤获得：(1)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H7N9禽流感病毒的血凝素蛋白对小鼠进行免疫；每只小鼠以30微克的抗原蛋白混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次，共2次；第3次加强免疫3天后用于融合；(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；(3)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法；以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天，将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海波，吴南屏，姚航平，杨帆，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33