可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及其制备方法、应用方法技术

本发明专利技术公开了一种可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及其制备方法、应用方法，该芯片由ZnO‑Ag复合材料基底、核苷酸序列，5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料RhB的序列片段组成。所述芯片由复合材料与生物传感探针构成，共价连接在芯片上的DNAzyme可以对铀酰离子有特异性响应，生物活性被激活，使得底物链断裂成两段自由的DNA，修饰于一段DNA上的荧光分子，由于DNA序列的断裂，坠落到SERS基底表面，因而可检测到较强的SERS信号，达到较高的灵敏度、特异性、可重现性。同时，通过修补断裂后的序列，该生物传感探针可以循环使用，达到高效检测、降低成本的目的。

Biosensor Chip for Circulating Detection of Trace Uranyl Ions and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及其制备方法、应用方法
本专利技术涉及可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，更具体地，本专利技术涉及一种基于可循环使用生物传感器检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及方法，属于水环境中痕量离子的检测领域。
技术介绍
众所周知，铀是一种重要的天然放射性元素，其在核能源领域发挥着重要作用。然而，铀具有危险的化学毒性和放射性，一旦扩散到环境中，可能造成难以挽回的生物危害。铀酰离子(UO22+)是铀在水环境中的主要存在形式，具有很高的生物相容性。目前用于水环境中痕量铀酰离子(UO22+)检测的主要方法有射线检测法、X射线荧光法、原子光谱法和ICP-MS法等。这些方法需要价格昂贵的精密仪器和复杂费时的前处理过程，无法满足现场快速检测的需要。近年来，以DNAzyme为探针的生物传感器成为科学家们争相研究的新领域。在前期的研究中，以DNAzyme为主要链段的生物传感器被设计作为重金属汞、铅、铜等的高灵敏特异性生物传感器，铀酰离子作为一种特殊的重金属离子，报道却比较少见。导致目前已有的检测铀酰离子的方法种类单一，灵敏度较低，选择性差，或因抗基质干扰能力较低，无法用于实际环境水样中痕量铀酰离子(UO22+)的现场快速检测。因此，目前迫切需要一种高灵敏、选择性好的铀酰离子检测方法，以实现对其的实时、快速的现场检测。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片及其制备方法、应用方法，利用包含有能与铀酰离子有特异性响应的DNA酶和捕捉底物链序列的DNA单链，通过信报分子的信号可以间接探测铀酰离子。本专利技术能够超灵敏检测铀酰离子，可检测出浓度低至1.0×10-12M的铀酰离子，有效解决了现有检测技术灵敏度和选择性不高的问题。同时，通过对生物探针的重新设计及修饰，在检测完成后，可以将断裂的底物链进行修护，让其循环使用，继续检测是体系中的铀酰离子。本专利技术具有简单、方便、易于携带，可重复使用，能实时、在线检测铀酰离子的浓度，具有很好的应用前景。本专利技术是这样实现的：首先，本专利技术提供了一种可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，由ZnO-Ag复合材料、DNAzynme底物链、DNAzynme酶链组成，酶链的5’端偶联巯基，3’端偶联荧光染料；酶链核苷酸序列：RhBCCCCGCTCAAGTCTGGATTACACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGTAAGCCTTT-(CH2)6HS5’-3’；底物链核苷酸序列：AAAGGCTTTTAATCACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGTAATCCAGACTTGAGCGGG5’-3’；其中，5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列通过末端巯基与ZnO-Ag复合材料中的银纳米颗粒共价连接，底物链与酶链的核苷酸序列彼此形成互补双链连接。本专利技术还提供了可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的制备方法，该制备方法包括以下步骤：步骤1、制备聚苯乙烯(PS)微球模板，在模板上制备ZnO-Ag复合材料，然后将其作为SERS基底；在PS微球模板上生长ZnO-Ag可以利用水热法；步骤2、将所述SERS基底，与5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列恒温混匀并振荡反应，使酶链核苷酸序列末端巯基与SERS基底上的银纳米粒子共价连接形成银-硫键，然后向溶液中加入盐溶液，过夜老化；步骤3、将老化后的材料取出，与溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列恒温混合孵育，通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲溶液冲洗，氮气吹干，得到可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，也可叫做DNAzyme生物传感SERS芯片。酶链核苷酸序列是5’端偶联有HS-(CH2)6-、3’端偶联有RhB荧光染料的序列片段。制备可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的过程中，使用的酶链和底物链核苷酸序列的浓度均在0.001～1M范围内。在没有特别说明的情况下，本专利技术中涉及到的浓度单位“M”是代表“mol/L”。制备芯片的过程中，步骤2所述恒温混匀是在25℃的温度下混匀；步骤3所述恒温混合孵育为在37℃孵育1～24h。步骤2所述加入盐溶液为将初始浓度为1M的盐溶液，每隔两小时分2-4次加入，溶液中盐的最终浓度为0.05～1M。这里的盐是指NaCl。同时，本专利技术还提供了可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的应用方法，由于该芯片可多次利用，因此在首次利用后需要进行处理才能再次利用，芯片具体的应用方法如下：首次检测：直接将该芯片浸泡到待测铀酰离子溶液中一段时间后取出，用共聚焦显微拉曼光谱仪进行检测；再次检测：在利用所述芯片检测铀酰离子溶液后，用PBS缓冲液冲洗芯片的基底表面，冲洗后将基底浸泡到有与酶链相匹配的溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列中，恒温混合孵育，通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲液冲洗，氮气吹干，重新得到检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，并用于检测铀酰离子。应用芯片进行检测时，将芯片浸泡到待测铀酰离子溶液中的时间为10-20min。应用后重新得到检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的过程中，所述PBS缓冲液的pH值为6.88，所述溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列的浓度为0.001M，恒温混合孵育条件为：37℃恒温孵育24h。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果：(1)本专利技术利用标记有表面增强拉曼探针RhB的对铀酰离子具有特异性识别和切割作用的DNAzyme作为UO22+的生物传感单元、能与之发生底物链断裂反应，断裂后，长酶链发生弯曲，贴近于SERS基底表面，产生探针分子的拉曼信号，实现对水样中痕量UO22+的高灵敏快速检测；所建立的检测方法具有灵敏度高、选择性好、抗基体干扰能力强、简单快速等优点。同时，通过简单冲洗，对断裂的底物链进行修护，重建DNAzyme生物传感器的双链状态，使其可以重复使用，循环使用次数大于3次。该方法克服了传统UO22+离子检测方法仪器昂贵、前处理操作复杂等缺点，可用于水样中痕量铀酰离子的现场快速和低成本检测；可以探测浓度低至1×10-12M的铀酰离子，能够超灵敏检测铀酰离子，可满足实际水样中痕量UO22+离子的现场快速检测需要，无需借助大型昂贵的仪器。(2)本专利技术的方法操作简单，检测速度快，检测整个过程在30分钟之内完成。(3)本专利技术所建立的检测方法具有良好的选择性，其它13种常见离子(Ag+、Mg2+、Fe3+、Ca2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、Th4+、Ba2+、Mn2+)，不干扰UO22+离子的检测。(4)本专利技术所建立的检测方法具有良好的抗基质干扰能力，检测水样无需复杂的前处理过程，只需要过滤去除水样中的沙土及悬浮物，便可立即检测。附图说明图1是本专利技术芯片检测铀酰离子过程及芯片重建示意图；图2是本专利技术实施例一不同浓度的铀酰离子溶液的SERS检测图。图3是本专利技术实施例一不同浓度的铀酰离子溶液的标准曲线图。图4是本专利技术实施例二中干扰离子测试结果图。图5是本专利技术实施例三中循环测试图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，其特征在于由ZnO‑Ag复合材料、DNAzynme底物链、DNAzynme酶链组成，酶链的5’端偶联巯基，3’端偶联荧光染料；酶链核苷酸序列：RhBCCCCGCTCAAGTCTGGATTACACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGTAAGCCTTT‑(CH2)6HS 5’‑3’；底物链核苷酸序列：AAAGGCTTTTAATCACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGTAATCCAGACTTGAGCGGG 5’‑3’；其中，5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列通过末端巯基与ZnO‑Ag复合材料中的银纳米颗粒共价连接，底物链与酶链的核苷酸序列彼此形成互补双链连接。

【技术特征摘要】
1.一种可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片，其特征在于由ZnO-Ag复合材料、DNAzynme底物链、DNAzynme酶链组成，酶链的5’端偶联巯基，3’端偶联荧光染料；酶链核苷酸序列：RhBCCCCGCTCAAGTCTGGATTACACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGTAAGCCTTT-(CH2)6HS5’-3’；底物链核苷酸序列：AAAGGCTTTTAATCACTCACTATrAGGAAGAGATGGACGTGTAATCCAGACTTGAGCGGG5’-3’；其中，5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列通过末端巯基与ZnO-Ag复合材料中的银纳米颗粒共价连接，底物链与酶链的核苷酸序列彼此形成互补双链连接。2.权利要求1所述的可循环检测痕量铀酰离子的生物传感芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1、制备聚苯乙烯微球模板，在模板上制备ZnO-Ag复合材料，然后将其作为SERS基底；步骤2、将所述SERS基底，与5’端偶联巯基、3’端偶联荧光染料的酶链核苷酸序列恒温混匀并振荡反应，使酶链核苷酸序列末端巯基与SERS基底上的银纳米粒子共价连接形成银-硫键，然后向溶液中加入盐溶液，过夜老化；步骤3、将老化后的材料取出，与溶解于杂交缓冲液中的底物链核苷酸序列恒温混合孵育，通过DNA互补配对形成DNA双链结构，然后用PBS缓冲溶液冲洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：何璇，刘渝，
申请(专利权)人：中国工程物理研究院化工材料研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51