小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其生产方法技术

本发明专利技术涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其制备方法。本发明专利技术采用小反刍兽疫病毒PPRV 75/1‑Clone 9株和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(CVCC No.AV41)作为疫苗生产毒株分别在Vero细胞和山羊肾细胞培养收获的病毒液经灭活处理后浓缩，两者再混合后加佐剂经乳化制备成有效地预防小反刍兽疫和山羊痘的二联灭活疫苗。该方法采用山羊肾细胞培养山羊痘病毒，改进了生产工艺，克服了用原代细胞制备抗原带来的外源病毒污染、批次不稳定等问题；浓缩及灭活工艺确保的疫苗效力，解决了活疫苗潜在的毒力返强的风险，该产品的研发成功，为规模化厂羊痘及小反刍兽疫的净化提供了物质保障，也为我国小反刍兽疫根除计划的实施提供基础。

The inactivated vaccine of small ruminant pest and goat pox and its production method

【技术实现步骤摘要】
小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其生产方法
本专利技术涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
小反刍兽疫和山羊痘是山羊的两种传染性疫病。小反刍兽疫(Pestedespetitsruminants,PPR)也称为小反刍兽伪牛瘟、卡他、肺肠炎以及口肺肠炎综合症，是由小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminants,PPRV)引起的小反刍兽一种急性传染病。联合国粮农组织(FAO)和国际兽医局(OIE)都将此病列为A类烈性传染病，在我国该病也被列为一类动物传染病。1942年，世界上首次在西非的科特迪瓦报道发生小反刍兽疫。随后的几年里，在尼日利亚、塞尔维亚和加纳等非洲国家都报道发生此病。近几年来，小反刍兽疫又有进一步蔓延发展的趋势，并且流行形势日益严峻。到目前为止，中非、东非、西亚以及南亚的许多国家都报道发生过小反刍兽疫。世界各国对此病都予以高度重视，美国、韩国、印度等国家都在积极进行相关方面的研究工作。我国在2007年7月首次在西藏阿里地区报道发生小反刍兽疫，给我国的养羊业造成了重大的损失。PPRV主要感染山羊和绵羊等小反刍兽，但是不同品种的羊敏感性有显著差别。山羊比绵羊更易感，其中欧洲品系的山羊更为易感。幼龄动物易感性较高，但是哺乳期的动物抵抗力较强。PPR一般多发生在雨季以及干燥寒冷的季节。山羊的发病率可以达到100％，死亡率在20％-90％不等，严重爆发时死亡率也能够达到100％。耐过动物经过一段时间可以恢复健康。研究表明，山羊在感染PPRV后的四年时仍能够检测到抗体。防制PPR的主要措施就是进行疫苗免疫接种。由于PPRV和牛瘟病毒(Rinderpestvirus，RPV)之间的抗原相关性很强，可用RPV组织培养的牛瘟活疫苗对绵羊、山羊进行免疫，并获得了很好的免疫保护效果，但是这种疫苗不利于在全球牛瘟消灭计划的实施，主要在非洲一些少数国家和地区有所使用。目前OIE在发生小反刍兽疫的国家和地区推荐使用的疫苗是PPRV75/1株的生产的弱毒活疫苗。有研究人员还利用基因反向遗传技术研究成功PPRV/RPV的嵌合体疫苗，即利用PPRV的糖蛋白基因取代RPV表面的相应糖蛋白基因。利用这种方法构建的疫苗，对PPRV能够产生良好的免疫原性。此外，G.Berhe等将小反刍兽疫的F基因克隆到山羊痘病毒中构建了基因重组疫苗，能够抵抗小反刍兽疫强毒的感染，但是还没有应用到临床生产实践中。小反刍兽疫活疫苗是由1975年从尼日利亚分离到的PPRV75/1株病毒接种Vero细胞并连续传代达70代以后致弱获得的疫苗毒株。目前OIE参考实验室已经传代至120代，病毒仍然保持一定的免疫保护力。毒株在细胞上繁殖以后以冻干的形式－20℃条件下保存。山羊痘(Goatpox)是由山羊痘病毒(Goatpoxvirus)引起的山羊的一种高度接触性传染病。临床特征与绵羊痘相似。主要表现为皮肤和粘膜上出现疱疹，进而形成痘肿，并渐进发展为化脓，结痂和引起全身痘及全身性反应。但临床上也有痘肿不经化脓过程的，即所谓“石痘”。重症患羊多出现内脏器官病变和死亡。本病在地中海地区，非洲、和亚洲的一些国家，以及中、近东一带均有发生。也偶见欧洲部分地区和澳大利亚。呈散发或地方性流行。其病状和死亡率，因毒株及宿主不同而有差异。有报告称土耳其的死亡率为3％～40％(Chefik)；摩洛哥的死亡率为5％～70％(Grimpret)等。本病在我国五十年代，仅见三北地区(西北、华北、东北)流行。但最近几年，南方数省、区亦有发生。山羊痘在我国的发病率可高达37.59％(陕西榆林地区，1985)。死亡率多在3％(青海省，1953年)～15.13％(陕西榆林地区，1985)之间。山羊痘严重影响了我国养羊业和制革工业的发展。山羊痘病毒为双股DNA病毒，属豆病毒科，山羊痘病毒属成员。该病毒嗜上皮性，没有血清型的区别。病毒容易在羔羊及犊牛的睾丸细胞和肾细胞上生长、繁殖，并致明显的细胞病变(CPE)。病毒也可在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上繁殖，但继代时要与羊体交替进行。否则，继代的代数有限。山羊痘疫苗有灭活疫苗和弱毒活疫苗两类。前者，是国外至今广为使用的疫苗。后者，是我国1984年以来使用的疫苗。目前市场上已有小反刍兽疫活疫苗和山羊痘活疫苗，需要多次分别注射，使用不方便，而多联疫苗虽然使用比较方便，但疫苗各免疫抗原成分之间往往会产生干扰作用。因此在制备小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗时，应保证两者不产生免疫干扰现象，即不降低各自的免疫效果。
技术实现思路
本专利技术目的在于用小反刍兽疫病毒弱毒Clone9株接种Vero细胞培养，山羊痘病毒弱毒AV41株接种山羊肾细胞培养，收获细胞培养物，将培养物浓缩后分别经β-丙内酯灭活，以适当比例混合后与矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防小反刍兽疫和山羊痘。本专利技术技术方案1.一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有小反刍兽疫病毒弱毒株灭活病毒(Pestedespetitsruminants,PPRV)和山羊痘病毒(Goatpoxvirus)弱毒株灭活病毒，可同时预防小反刍兽疫和山羊痘。2.本专利技术所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于：所述小反刍兽疫病毒弱毒株活病毒为小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminants)PPRV75/1-Clone9株，该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.13388。3.本专利技术所述的小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于所述山羊痘病毒弱毒株活病毒为山羊痘病毒(Goatpoxvirus)温度敏感弱毒株，保藏编号为：CVCCNo.AV41。4.本专利技术所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于用所述小反刍兽疫病毒75/1Clone9株(CGMCCNo.13388)和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(AV41)病毒作为疫苗生产毒株，分别接种Vero细胞和山羊肾细胞单层，当细胞出现细胞病变达70％以上时，将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次，分别收获病毒液经灭活处理；再将其混合后加疫苗佐剂、乳化后制成小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗。5.本专利技术所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于其中的佐剂为206佐剂。本专利技术的有益效果本专利技术涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗及其制备方法。本专利技术采用小反刍兽疫病毒PPRV75/1-Clone9株和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(CVCCNo.AV41)作为疫苗生产毒株分别在Vero细胞和山羊肾细胞培养收获的病毒液经灭活处理后浓缩，两者再混合后加佐剂经乳化制备成有效地预防小反刍兽疫和山羊痘的二联灭活疫苗。该方法采用山羊肾细胞培养山羊痘病毒，改进了生产工艺，克服了用原代细胞制备抗原带来的外源病毒污染、批次不稳定等问题；浓缩及灭活工艺确保的疫苗效力，解决了活疫苗潜在的毒力返强的风险，该产品的研发成功，为规模化厂羊痘及小反刍兽疫的净化提供了物质保障，也为我国小反刍兽疫根除计划的实施提供基础。本专利技术涉及生物材料资源信息小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminan本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有小反刍兽疫病毒弱毒株灭活病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)和山羊痘病毒(Goat pox virus)弱毒株灭活病毒，可同时预防小反刍兽疫和山羊痘。

【技术特征摘要】
1.一种小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有小反刍兽疫病毒弱毒株灭活病毒(Pestedespetitsruminants,PPRV)和山羊痘病毒(Goatpoxvirus)弱毒株灭活病毒，可同时预防小反刍兽疫和山羊痘。2.权利要求1所述小反刍兽疫、山羊痘二联灭活疫苗，其特征在于：所述小反刍兽疫病毒弱毒株活病毒为小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminants)PPRV75/1-Clone9株，该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.13388。3.权利要求1所述的小反刍兽疫、山...

【专利技术属性】
技术研发人员：支海兵，冯忠泽，薛青红，印春生，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11