一种PCV2、CSFV IgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法技术

本发明专利技术公开了一种PCV2、CSFV IgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法。2型猪圆环病毒Cap基因片段和猪瘟病毒E2基因片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～2所示，其编码的重组蛋白作为抗原分别与羧基化荧光微球偶联并建立了双重FMIA检测方法。本检测方法速度快、特异性强、敏感度高；E2抗体和Cap抗体检测方法的重复性好，与其他常见猪病毒病阳性血清无交叉反应，灵敏度高、特异性强；与商业化ELISA试剂盒相比，灵敏度更高。该方法可同时用于猪瘟病毒和圆环2型病毒感染猪的快速鉴别诊断及保护性抗体的检测，为进一步建立猪病毒病抗体多重检测方法奠定了实验基础，为其他动物疫病抗体的新型血清学诊断技术的建立提供了思路。

A Double Fluorescent Microsphere Immunoassay for PCV2 and CSFV IgG Antibodies

The invention discloses a double fluorescent microsphere immunoassay method for PCV2 and CSFV IgG antibodies. The Cap gene fragment of type 2 porcine circovirus and the E2 gene fragment of hog cholera virus are shown. Their nucleotide sequences are shown in SEQ ID NO:1 ~ 2, respectively. The encoded recombinant protein is coupled with carboxyl fluorescent microspheres as antigen, and a double FMIA detection method is established. The detection method is fast, specific and sensitive. E2 antibody and Cap antibody detection method has good repeatability, and has no cross reaction with other common swine virus * positive sera, and has high sensitivity and specificity. Compared with commercial ELISA kit, the sensitivity is higher. This method can be used for the rapid differential diagnosis and detection of protective antibodies against hog cholera virus and ring type 2 virus infected pigs. It lays the experimental foundation for the further establishment of multiple detection methods for swine virus disease antibodies, and provides a new idea for the establishment of new serological diagnostic techniques for other animal diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种PCV2、CSFVIgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法
本专利技术涉及免疫学与病毒检测
，更具体地，涉及一种PCV2、CSFVIgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法。
技术介绍
中国是养猪最多的国家，养猪在养殖业中有着举足轻重的地位，随着我国经济发展，养殖业的规模也将逐渐扩大，趋向于规模化、集约化养殖。随之而来的问题也慢慢浮现出来，尤其是猪传染病对养殖业的危害日渐突出。猪瘟(Classicalswinefever,CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的猪的一种急性或慢性、热性和高度接触性传染病。猪瘟是我国最主要的猪病之一，世界动物卫生组织(OIE)将本病列入法定的A类传染病，虽然世界上有不少国家已消灭了猪瘟，但我国地理环境复杂，流行形式多变，所以每年国家都指定必须免疫。猪瘟每年给养猪业造成严重的经济损失。该病以发病急、持续高热，全身泛发性小点出血，发病率和死亡率高为特征,猪(家猪和野猪)是唯一的易感宿主。猪瘟呈世界性分布，由于其危害程度高，近几十年来给养猪业造成了巨大的损失，不少国家先后采取了消灭猪瘟的措施。2型猪圆环病毒(PCV2)，一种小的，无包膜的单链DNA病毒被认为是断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要原因。PMWS的临床症状包括进行性体重减轻，呼吸系统疾病，黄疸和死亡率增加。猪圆环病毒2型对猪的危害极大，引起猪的一系列相关的临诊病症，其中包括PMWS、皮炎肾病综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍等，给养猪业造成巨大的危害。猪病毒性传染病主要特点是：传播速度快、流行性广，危害大。猪瘟、猪圆环病2型这两种疾病作为一种急性病毒性传染病，有着传播快、流行广、易爆发的特点，且通常呈现为混合感染，造成繁殖障碍、免疫抑制，对养猪业带来巨大的经济损失。因此建立一种快速、高效的检测方法极其重要。Flexmap3D检测系统可在20min内检测96个样品，可定性或定量的检测单个样品种的500种待检分子，具有通量高、灵敏度高、特异性好等优点被誉为是后基因组时代的芯片技术。采用的是Luminex的多指标同步分析(FlexibleMulti-AnalyteProfiling，xMAP)技术，也被称为液相蛋白芯片技术，用于抗体检测时被称作荧光微球免疫学检测方法(Fluorescent-microbeadimmunoassay，FMIA)。经过十多年的发展，液相蛋白芯片技术已经成为研究蛋白质组学和基因组学的新型工具。FMIA是一种有研究前景的诊断和监测免疫学分析方法，与传统的ELISA免疫法相比，需要的样本量更小，时间和经济成本更低，而且它克服了ELISA对单个分析物的要求限制但至今没有一种同时检测猪瘟、猪圆环病2型这两种疾病的荧光微球免疫学检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种PCV2、CSFVIgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法，为进一步建立猪病毒病抗体多重检测方法奠定实验基础，为其他动物疫病抗体的新型血清学诊断技术的建立提供思路和理论基础。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利技术通过优化PCV2Cap和CSFVE2基因的扩增片段，利用原核表达载体pMAL-c5X对猪瘟病毒E2蛋白、2型猪圆环病毒Cap蛋白进行可溶性表达，以制备的重组蛋白为抗原与微球偶联，以猪血清为待检样品，将CSFV-E2、PCV2-Cap重组蛋白作为抗原分别与60、40号珠微球偶联分别建立了CSFV、PCV2、IgG抗体的单项荧光微球免疫学检测方法(单项FMIA)检测方法，并在此基础上建立了双重FMIA检测方法。实验早期在PCV2Cap和CSFVE2基因扩增过程中，针对几个主要的抗原表位进行其基因的PCR扩增，并构建表达质粒，发现并非所有的基因片段都能表达出可溶性的蛋白，经过筛选后，在大肠杆菌表达系统中表达了PCV2Cap和CSFVE2的氨基酸残基，表达出可溶性的蛋白，经纯化后作为抗原进行后续的研究。目前在大肠杆菌中表达的PCV2Cap和CSFVE2基因，大多以包涵体的形式存在，然而包涵体的纯化步骤复杂、对蛋白样品要求也更高。本专利技术采用了成熟的原核蛋白表达体系，表达载体选择了容易表达可溶性蛋白的pMAL-c5X载体，其载体上带有MBP标签，可增加重组蛋白的可溶性，同时在目的基因后面添加6个His标签使重组蛋白更加容易纯化。通过不断优化诱导条件在16℃、IPTG终浓度为0.3mM的条件下诱导表达6～8h后，成功表达出融合了His标签及MBP标签的pMAL-c5x-CSFV-E2和pMAL-c5x-PCV2-Cap重组蛋白。在实验中发现低温低速延长诱导时间，减缓蛋白表达速度，使其更趋向于上清表达。因此本专利技术要求保护以下内容：2型猪圆环病毒Cap基因片段在检测2型猪圆环病毒或制备2型猪圆环病毒检测试剂盒中的应用，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。猪瘟病毒E2基因片段在检测猪瘟病毒或制备猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。2型猪圆环病毒Cap重组蛋白在检测2型猪圆环病毒或制备2型猪圆环病毒检测试剂盒中的应用，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。猪瘟病毒E2重组蛋白在检测猪瘟病毒或制备猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。一种重组的载体，含有核苷酸序列如SEQIDNO:1所示2型猪圆环病毒Cap基因片段。一种重组的载体，含有核苷酸序列如SEQIDNO:2所示猪瘟病毒E2基因片段。优选地，所述载体为pMAL-c5X载体。一种重组的菌株，含有以上重组载体。优选地，所述菌株为BL21(DE3)。一组用于检测2型猪圆环病毒和猪瘟病毒的羧基化荧光微球组，包括偶联有氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的2型猪圆环病毒Cap重组蛋白的羧基化荧光微球和偶联有权利氨基酸序列如SEQIDNO:4所示的猪瘟病毒E2重组蛋白的羧基化荧光微球；其中，2型猪圆环病毒Cap重组蛋白和猪瘟病毒E2重组蛋白均通过将其编码DNA序列连接入pMAL-c5X载体，并转入原核表达菌诱导表达，诱导条件为12～37℃、IPTG终浓度为0.3～1.0mM的条件下诱导表达6～8h。优选地，诱导条件为16℃、IPTG终浓度为0.3mM的条件下诱导表达6～8h。优选地，诱导表达后，破碎上清，用GE公司Ni2+亲和层析柱进行纯化。优选地，纯化时，2型猪圆环病毒Cap重组蛋白经20～500mM的咪唑溶液1～2两次洗杂。更优选地，纯化时，2型猪圆环病毒Cap重组蛋白经300mM的咪唑溶液2两次洗杂，洗脱下来的目的蛋白纯度较高，杂蛋白基本去除。优选地，纯化时，猪瘟病毒E2重组蛋白经20～500mM的咪唑溶液1～2两次洗杂。更优选地，纯化时，猪瘟病毒E2重组蛋白经200mM的咪唑溶液2两次洗杂，洗脱下来的目的蛋白纯度较高，杂蛋白基本去除。优选地，偶联有2型猪圆环病毒Cap重组蛋白的是40号微球。优选地，偶联有猪瘟病毒E2重组蛋白的是60号微球。所述的羧基化荧光微球组在制备检测2型猪圆环病毒和猪瘟病毒的试剂盒中的应用。一种检测2型猪圆环病毒和猪瘟病毒的试剂盒，包括所述的羧基化荧光微球组。优选地，还含有链霉素-藻红蛋白，生物素标记的二抗。优选地，还本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.2型猪圆环病毒Cap基因片段在检测2型猪圆环病毒或制备2型猪圆环病毒检测试剂盒中的应用，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.2型猪圆环病毒Cap基因片段在检测2型猪圆环病毒或制备2型猪圆环病毒检测试剂盒中的应用，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.猪瘟病毒E2基因片段在检测猪瘟病毒或制备猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。3.2型猪圆环病毒Cap重组蛋白在检测2型猪圆环病毒或制备2型猪圆环病毒检测试剂盒中的应用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。4.猪瘟病毒E2重组蛋白在检测猪瘟病毒或制备猪瘟病毒检测试剂盒中的应用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。5.一组用于检测2型猪圆环病毒和猪瘟病毒的羧基化荧光微球组，其特征在于，包括偶联有氨基酸序列如SEQIDNO:3所示的2型猪圆环病毒Cap重组蛋白的羧基化荧光微球和偶联有氨基酸序列如SEQIDNO:4所示的猪瘟病毒E2重组蛋白的羧基化荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂红，冀池海，王衡，曾梦，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44