一种马铃薯黄化矮缩病毒RT-LAMP检测引物组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种马铃薯黄化矮缩病毒RT‑LAMP检测引物组及其应用。用于检测马铃薯黄化矮缩病毒的LAMP引物组由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成。本发明专利技术还提供了一种应用上述引物的马铃薯黄化矮缩病毒RT‑LAMP检测方法，其具体步骤包括：1）待测样品RNA提取；2）RT‑LAMP反应体系的建立；3）结果检测。本发明专利技术的RT‑LAMP反应体系在63℃等温条件下进行，通过1h温育便能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到马铃薯黄化矮缩病毒。本发明专利技术不需要复杂仪器，能很好地满足对马铃薯黄化矮缩病毒的现场检测，在马铃薯黄化矮缩病毒监测、检测和鉴定上具重要的应用价值。

RT-LAMP primers for detection of potato yellow dwarf virus and its application

The invention discloses a primer group for detecting potato yellowing dwarf virus RT LAMP and its application. The LAMP primers used to detect potato yellow dwarf virus consist of a pair of outer primers F3/B3 and a pair of inner primers FIP/BIP. The invention also provides a method for detecting potato yellow dwarf virus RT LAMP using the above primers. The specific steps include: 1) RNA extraction of the sample to be tested; 2) establishment of RT LAMP reaction system; 3) result detection. The RT LAMP reaction system of the invention is carried out under the condition of isothermal incubation at 63 C. The potato yellow dwarf virus can be quickly, conveniently, efficiently, highly specific and highly sensitive detected by incubation at 1 hour. The invention does not need complex instruments, can well meet the field detection of potato yellow dwarf virus, and has important application value in the monitoring, detection and identification of potato yellow dwarf virus.

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯黄化矮缩病毒RT-LAMP检测引物组及其应用
本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治
，具体涉及一种马铃薯黄化矮缩病毒RT-LAMP检测引物组及其应用。
技术介绍
马铃薯黄化矮缩病毒(Potatoyellowdwarfvirus，PYDV)属于弹状病毒组(Rhabdovirus)。马铃薯黄化矮缩病毒能侵染双子叶植物的茄科、菊科、十字花科等植物60余种，自然寄主有马铃薯、花烟草、山芥等。马铃薯黄化矮缩病毒分为SYDV和CYDV两个株系。马铃薯黄矮病毒为杆菌状粒体，在植物重切片大小约为380×75nm。病毒外膜由厚约3.5nm和间隔约5nm的三层构成。马铃薯黄化矮缩病毒可以通过马铃薯的种薯、介体、嫁接进行传播。传毒叶蝉从吸毒到传播需6~10天，病毒在虫体内可以存活50天之久。若虫、雌、雄成虫均能传毒，病毒还能在成虫体内越冬。马铃薯黄化矮缩病毒的传播方式多种多样，最主要的方式就是通过马铃薯的种薯进行传播，其次还可以通过昆虫细菌等介体进行传播，再次嫁接过的植物也可以成为传毒的媒介。其中比较显著的昆虫介体有叶蝉，马铃薯黄化矮缩病毒可以在叶蝉的体内存活50天之久，并且叶蝉的若虫、雌虫、雄虫都可以传播该病毒，甚至还可以在叶蝉的成虫体内越冬。马铃薯茎的生长点早期坏死，以及中期病株的矮缩症状甚至后期的黄化症状都是马铃薯黄化矮缩病毒导致的。植株上部的茎常开裂，由开裂处可看到茎节的髓部及皮层有锈色斑点，有时节间的髓部及皮层也出现锈斑。在被马铃薯黄化矮缩病毒感染过的植株会出现节间缩短的现象，这种症状会引起丛枝现象。小叶通常卷曲,但有时也皱缩,块茎小而少，块茎与茎部的距离很近，有时块茎也开裂。块茎的髓部及韧皮部有锈色或褐色的斑点，维管束很少变色。在田间生产中，变色斑有时会出现在刚收获不久的马铃薯块茎上，但是马铃薯矮缩病毒一般不会侵染马铃薯块茎的端部。目前，防控马铃薯病毒病危害的化学药剂还比较少，所以脱毒的种苗和种薯成了防治病毒病比较有效的办法。因此，高效可靠的病毒检测方法是保证马铃薯品质和质量的关键。目前，广泛应用于马铃薯病毒检测的方法主要为：血清学方法和分子生物学方法。近年来分子生物学检测技术发展迅速，分子生物学检测技术有高效、特异性强和灵敏性高等优点，被广泛的应用于马铃薯病毒检测中，其中应用最多的为反转录-聚合酶链式反应，为马铃薯病毒及脱毒种苗的检测提供了更为简便，准确的诊断方法。这为马铃薯病毒病的预防、控制和检测提供了重要的参考。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是日本学者Notomi公开发表的一种新型的，适用于基因鉴定的核酸扩增技术。在60-65℃恒温以及链置换DNA聚合酶催化的条件下，特异性的针对靶基因的6个区域设计LAMP引物，能与目标序列的两端结合循环产生环状单链结构，不断的产生新链的合成，15-60min即可实现目标基因高效扩增，便可将目的基因片段扩增到109-1010个数量级，反应中产生副产物焦磷酸镁沉淀可通过肉眼观察，可以看到明显的白色沉淀，为了更加准确的对副产物焦磷酸镁沉淀进行定时定量的监控，可通过实时浊度仪检测浊度来观察结果。LAMP方法和PCR反应相比，其优点在于不需要进行反复热变性和反复升降温这样繁琐且时间较长的操作过程，反应体系置于恒温条件下就可进行持续的快速扩增，经济、便捷。且反应体系稳定可靠，针对基因的六个位点进行识别，使其具有很高的灵敏性和特异性，并且能够快速检测病毒，对于污染样品和干扰片段不影响其进行检测。由RNA快速抽提法与RT-LAMP相结合的一步法RT-LAMP技术使检测速率进一步得到提升。目前RT-LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，关于马铃薯黄化矮缩病毒的RT-LAMP检测国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中对马铃薯黄化矮缩病毒检测和鉴定主要基于形态学特征和血清学检测，检测方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了马铃薯黄化矮缩病毒新的分子检测方法，对马铃薯黄化矮缩病毒进行RT-LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1.马铃薯黄化矮缩病毒RT-LAMP检测引物组：根据NCBI中已发表的马铃薯黄化矮缩病毒(Potatoyellowdwarfvirus，PYDV)RTRPmRNA序列，采用DNAStar6.0软件进行序列比对，根据马铃薯黄化矮缩病毒的高度保守区域RDRP和NP序列进行引物设计。根据LAMP引物设计的原则，利用PrimePremier4.0软件，针对其2个特定区域，设计一套马铃薯黄化矮缩病毒特异性RT-LAMP引物组，由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP核苷酸序列如下：F3:5’-GAGACAGAGAGTGGCATTGG-3’，B3:5’-ATTGCATCCACCGGAGTG-3’，FIP:5’-TGGTGCTTCTTCATTGGCACGT-ATGCAGATGGGAGGAGCC-3’，BIP:5’-CAGAAGAGAGCCACACCAGCA-GATGCTGTTCCGGATGTCC-3’。2.马铃薯黄化矮缩病毒RT-LAMP检测方法，包括以下步骤：（1）待测样品RNA提取。采集新鲜且有黄化矮缩症状的马铃薯叶片，将其储存在-80℃的冰箱里。本实验采用TransZolUp试剂盒提取RNA。提取前，预先稀释好个别要求加入无水乙醇的试剂。具体步骤如下：称取0.1g的马铃薯样品，快速的转移到研钵中，加入液氮，用研杵充分研磨，研磨成粉末状后迅速转移至1.5mL离心管中，再加入1mLTranszoLUp试剂，然后加入0.2mL的氯仿，剧烈振荡30s后，室温下静置5min；4℃12000rpm，离心15min，取上清液；转移无色的水相于新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀；将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000g室温离心30s，弃掉流出液；加500mL的CB9，室温12000g离心30秒，弃掉流出液；重复步骤5一次；加500mL的WB9，室温12000g离心30秒，弃掉流出液；重复步骤7一次；室温12000g离心2分钟，彻底去除残留的乙醇；将离心柱放入新的离心管中，家50微升RNase-freeWater在离心柱的中央，室温静置1分钟，室温12000g离心1分钟，洗脱RNA，将RNA置于-80℃保存；（2）RT-LAMP反应体系的建立：25μL体系中含有10×Thermolpol缓冲液2.5μL、8000U/mL的Bst聚合酶1μL、10U/μL的AMV反转录酶1μL、RNA模板2.5μg、终浓度为1.2mM的dNTPs、终浓度为6mM的MgSO4、终浓度为1.6μM的内侧引物FIP、终浓度为1.6μM的内侧引物BIP、终浓度为0.4μM的外侧引物F3、终浓度为0.4μM的外侧引物B3，余量为水；（3）RT-LAMP反应条件：于实时浊度仪中进行反应，63°C恒温反应60min，80°C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马铃薯黄化矮缩病毒RT‑LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物组由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，其核苷酸序列如下：F3: 5’‑ GAGACAGAGAGTGGCATTGG‑3’，B3: 5’‑ ATTGCATCCACCGGAGTG‑3’，FIP: 5’‑ TGGTGCTTCTTCATTGGCACGT‑ATGCAGATGGGAGGAGCC‑3’，BIP: 5’‑ CAGAAGAGAGCCACACCAGCA‑GATGCTGTTCCGGATGTCC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯黄化矮缩病毒RT-LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物组由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，其核苷酸序列如下：F3:5’-GAGACAGAGAGTGGCATTGG-3’，B3:5’-ATTGCATCCACCGGAGTG-3’，FIP:5’-TGGTGCTTCTTCATTGGCACGT-ATGCAGATGGGAGGAGCC-3’，BIP:5’-CAGAAGAGAGCCACACCAGCA-GATGCTGTTCCGGATGTCC-3’。2.一种利用权利要求1所述引物组检测马铃薯黄化矮缩病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：（1）待测样品RNA提取；（2）RT-LAMP反应体系的建立：25μL体系中含有10×Thermolpol缓冲液2.5μL、8000U/mL的Bst聚合酶1μL、10U/μL的AMV反转录酶1μL、RNA模板2.5μg、终浓度为1.2mM的dNTPs、终浓度为6mM的MgSO4、终浓度为1.6μM的内侧引物FIP、终浓度为1.6μM的内侧引物BIP...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑璐平，沈建国，孟若雪，陈峰，姚锦爱，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35