The invention discloses the preparation of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody against Pasteurella proteins. The standard curve of the standard protein concentration is constructed by the BCA protein concentration method. The concentration of the purified protein to be tested is calculated by the standard curve, the antigen is prepared, and then the polyclonal antibody and monoclonal antibody against the toxA N protein of Pasteurella multoxA N toxin are prepared. The purified toxA_N protein was prepared into antigen by biotechnological method. Subcutaneous injection of rabbits and intraperitoneal injection of Kunming mice stimulated the immune response of the body and produced the corresponding host antibodies. When the polyclonal antibody was diluted at 1:6400, P/N was still > 2, while the monoclonal antibody was still > 2.5 at 1:64000 because of its high specificity.
【技术实现步骤摘要】
一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备
本专利技术属于毒素基因抗体制备领域，具体涉及一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备。
技术介绍
研究发现，多杀性巴氏杆菌众多的致病因子中以多杀性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)毒性最高，且在致病过程中扮演主要作用。目前，国内关于羊感染多杀性巴氏杆菌的研究很少，相应的疫苗研究也很缺乏，临产上主要以抗生素进行预防。因此，羊巴氏杆菌病疫苗的研究迫在眉睫。多杀性巴氏杆菌病是一种常见的人畜共患性疾病，其血清型多样，致病性复杂。通过血清型分型方法对多杀性巴氏杆菌进行分型，由荚膜抗原(K抗原)可分为A、B、D、E、F五种血清型，由脂多糖抗原(O抗原)分为16种血清型(1-16)，根据是否产多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)，分为非产毒多杀性巴氏杆菌(T-Pm)和产毒多杀性巴氏杆菌(T+Pm)。临床上，因抗原性和宿主特异性的差异，造成了多种临床症状，例如猪的萎缩性鼻炎，牛羊的出血性败血症，禽类的禽霍乱等。随着广谱抗生素的滥用，多杀性巴氏杆菌的致病率及家畜死亡率日益增高，严重危害我国养殖户的经济效益。多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)是一种大分子蛋白，相对分子质量为146ku，具有不耐热、不耐酸等特性。PMT蛋白是一种典型的AB结构蛋白，由C端和N端两个结构域构成，中间为跨膜部位。C端与生物活性效应有关，为催化作用位点，N端与靶细胞的结合以及生物胞吞作用有关，为黏附作用位点。研究发现，PMT蛋白N端是多杀性巴氏杆菌毒素与受体结合并发挥重要作用的桥梁，然而，天然和人工合成的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白分泌量很低，不到菌体的0.5％，但通过PMT...
【技术保护点】
1.一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1，多杀性巴氏杆菌毒素toxA‑N蛋白抗原的制备：步骤1.1：待测toxA‑N纯化蛋白浓度的测定采用BCA蛋白浓度测量方法，构建标准蛋白溶液浓度的标准曲线，取实验室制备的已纯化的待测多杀性巴氏杆菌毒素toxA‑N蛋白，通过标准曲线法计算待测toxA‑N纯化蛋白的浓度；步骤1.2：抗原的制备用灭菌后的生理盐水稀释步骤1.1中已知浓度的toxA‑N蛋白，并使其终浓度为1ug/μL，将稀释后的toxA‑N蛋白按1：1的比例与相应的弗氏佐剂进行乳化，用注射器快速吹打混合，直至乳化液滴到静止的水面上不扩散为止，即乳化完全，抗原制备成功；步骤2，多杀性巴氏杆菌毒素toxA‑N蛋白多克隆抗体的制备：将步骤1制备好的抗原免疫兔子，通过三次免疫刺激机体产生相应抗体，经效价检测，获取高效价血清，并将获得的血清，经间接ELISA及Western blot进行验证；步骤3：多杀性巴氏杆菌毒素toxA‑N蛋白单克隆抗体的制备以步骤1中制备的抗原，免疫BALB/c小鼠作为饲养细胞，依次通过细胞融合、筛选、单克隆抗体鉴定获得抗...
【技术特征摘要】
1.一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1，多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白抗原的制备：步骤1.1：待测toxA-N纯化蛋白浓度的测定采用BCA蛋白浓度测量方法，构建标准蛋白溶液浓度的标准曲线，取实验室制备的已纯化的待测多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白，通过标准曲线法计算待测toxA-N纯化蛋白的浓度；步骤1.2：抗原的制备用灭菌后的生理盐水稀释步骤1.1中已知浓度的toxA-N蛋白，并使其终浓度为1ug/μL，将稀释后的toxA-N蛋白按1：1的比例与相应的弗氏佐剂进行乳化，用注射器快速吹打混合，直至乳化液滴到静止的水面上不扩散为止，即乳化完全，抗原制备成功；步骤2，多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白多克隆抗体的制备：将步骤1制备好的抗原免疫兔子，通过三次免疫刺激机体产生相应抗体，经效价检测，获取高效价血清，并将获得的血清，经间接ELISA及Westernblot进行验证；步骤3：多杀性巴氏杆菌毒素toxA-N蛋白单克隆抗体的制备以步骤1中制备的抗原，免疫BALB/c小鼠作为饲养细胞，依次通过细胞融合、筛选、单克隆抗体鉴定获得抗体，并将获得的单克隆抗体进行鉴定。2.如权利要求1所述的一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，所述步骤1.1中toxA-N纯化蛋白标准曲线的建立按照步骤如下：1.1.1，取一块酶标板，先将酶标板孔依次编号为0、1、2、3、4、5、6、7，再在酶标板中依次加入蛋白标准溶液0、1、2、4、8、12、16、20μL，补充去离子水使每个酶标板中液体体积均为20μL，最后往酶标板中依次加入对应蛋白0、0.5、1、2、4、6、8、10μg，每组实验重复3次；步骤1.1.2，在酶标板每孔中加入BCA工作液200μL，充分混匀，于37℃放置30min；步骤1.1.3，提前15min打开酶标仪，将步骤1.1.2中的酶标板依次放入酶标仪中测定吸光值，测定波长为562nm；步骤1.1.4，根据步骤1.1.3中测量的数据绘制标准曲线；步骤1.1.5，将待测toxA-N蛋白样进行1：100稀释，稀释后总体积为20μL，再加入BCA工作液200μL，37℃放置30min，以标准曲线0号管作为对比，记录吸光值：3.如权利要求1所述的一种巴氏杆菌蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，其特征在于，所述步骤2具体按照以下步骤进行：步骤2.1：阴性血清的采集取两只兔子，于兔耳缘静脉进行血液采集，每只兔子采集5mL，常温下静置2h，4℃过夜静置，收集上清液并与-80℃保存，以备后续实验；步骤2.2：初免将稀释toxA-N蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫步骤2.1中的两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；步骤2.3：次免初免后14天后进行次免实验，稀释toxA-N蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；步骤2.4：三免次免后14天后进行三兔实验，稀释蛋白与弗氏佐剂混合，两种蛋白共配制4mL，乳化完全后分别免疫两只兔子，每只兔选取5个点进行免疫，共免疫1mL乳化液；步骤2.5：采集免疫后血清于三免后10天采集全血，每只兔采集不低于15mL血液，常温下静置2h，4℃过夜静置，收集上层抗体血清，-80℃保存，即制备出多克隆抗体；步骤2.6：多克隆抗体的鉴定(1)间接ELISA效价鉴定：对步骤2.5制备的血清用间接ELISA进行测定，于96孔板中加入每孔200ng抗原/100μl包被液，骨髓瘤细胞做梯度稀释，测定过...
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