一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法技术

本发明专利技术采用三价肠毒素融合蛋白(LTB蛋白‑STa蛋白‑STb蛋白)和K88天然菌毛，或者进一步包含K88全菌灭活苗作为免疫原，免疫蛋鸡获得了一种新的卵黄抗体，该卵黄抗体具有高效价、高抑菌活性和广谱性，对多种血清型大肠杆菌保护效果均良好，克服了现有制备技术中卵黄抗体抗原特异性强的缺点，为猪腹泻病的治疗和预防提供了新手段。

【技术实现步骤摘要】
一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种抗体及其制备方法，具体地说，涉及抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法。
技术介绍
畜牧养殖中抗生素滥用会导致细菌产生耐药性，一方面对于今后的畜禽疾病治疗产生困难，另一方面，畜禽产品被人类食用之后，会间接食入在畜禽体内残留的抗生素，导致人类感染疾病之后抗生素治疗效果大打折扣。因此，在畜禽养殖过程中，必须严格按照规定使用抗生素。最近，农业部再出重拳，发布公告第2638号，停止在食品动物中使用喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂等3种兽药。此次禁止后，养殖业就仅剩11种抗菌药允许添加到商品饲料中，随着日本、欧盟等国家和地区的全面禁止在养殖业中使用抗生素，中国预计在不远的将来也会全面禁止使用抗生素。因此，抗生素替代品的研发与应用成为养殖业一个迫切解决的难题。卵黄抗体是一种将特定病原菌注射在蛋鸡体内，由其生产的鸡蛋蛋黄中提取相应抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗的抗体。卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体还可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞，或使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性。因此，目前卵黄抗体作为一种很有潜力的抗生素替代品被广泛关注。断奶仔猪腹泻是常见的断奶应激性疾病，严重影响仔猪生产性能。产肠毒素大肠杆菌的肠毒素是导致腹泻发生的直接致病因子，根据热稳定性可以分为耐热性肠毒素(ST)和不耐热性肠毒素(LT)两类，二者可单独或共同存在于菌株中。LT有两种亚型LT-I和LT-II，前者具有致病性，由一个A亚基(LTA)和5个B(LTB)亚基组成。A亚基是毒素的活性部分，B亚基是毒素的免疫原性中心，单独的A或B亚基均没有生物学活性，只有聚合在一起才具有全毒素的生物学功能。ST根据在甲醇中的溶解性和致病性，一般分为ST1和ST2两类，其中ST1又根据宿主种类和核苷酸数目的差异分为ST1a(也称STa)和ST1b(也称STb)两种亚型，STb分子量较小，免疫原性很弱。目前，细菌性腹泻的防治主要采用大肠杆菌多价苗免疫和抗菌药治疗，但效果不是很明显。卵黄抗体作为一类可替代抗生素的高效生物防治制剂在防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻中显示出明显的效果，为该病的防治开辟了新的途径。将LTB与STa和STb蛋白融合起来具有良好的免疫原性；大肠杆菌的菌毛蛋白也具有良好的免疫原性，给机体免疫后产生的抗体在不同血清型大肠杆菌间均具有交叉保护效果。到目前为止已经有许多学者研究了抗大肠杆菌的卵黄抗体的制备方法，包括免疫原采用全菌灭活苗、大肠杆菌菌毛、融合蛋白及不同组合的联合免疫原等制备相应的卵黄抗体。如王吉潭等制备了抗大肠杆菌K88、K99和987P的卵黄抗体；陈娟、刘国华等制备了大肠杆菌菌毛抗原，并用于卵黄抗体的制备。彭健等采用TSB液体培养菌株和纯化获得特异菌毛黏附素蛋白，与佐剂混合制成免疫原，免疫产蛋鸡，制备预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体。由于大肠杆菌种类多，变异大、血清型复杂，目前这些方法产生的抗体特异性强，只针对免疫菌株有作用，对大肠杆菌的其他血清型细菌没有作用，很难在实际生产中进行推广应用。另外，有研究表明，多种抗原混合免疫蛋鸡时，免疫保护效果与单一抗原免疫相比可能有协同效应，也可能有负面影响(李建梅，2011)。因此，研究出一种广谱性的抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体，探究多种抗原混合免疫与单独免疫的免疫保护效果就显得愈发重要，这不仅减少了资源的浪费，提高了工作效率，而且有利于卵黄抗体在畜禽养殖中的推广应用，起到预防或治疗仔猪腹泻，为养殖业的健康发展和食品安全提供保障。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种针对猪产肠毒素大肠杆菌的广谱性、高效价卵黄抗体及其制备方法，以及该抗体或其制剂在制备治疗猪腹泻药物中的应用。本专利技术的方法克服了现有制备技术中抗原特异性强的缺点，建立了一种采用混合抗原作为免疫原的卵黄抗体的制备方法，并获得了高效价、高抑菌活性、可针对多种血清型的产肠毒素大肠杆菌、且无毒副作用，易于推广经济适用的抗体。本专利技术的目的通过如下技术方案来实现：一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体，其特征在于，以混合抗原免疫蛋鸡获得的卵黄抗体，所述混合抗原包含三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛。根据本专利技术，所述三价肠毒素融合蛋白是LTB蛋白、STa蛋白和STb蛋白顺序连接组成的融合蛋白，在所述三个蛋白之间存在或不存在柔性连接序列，例如，所述融合蛋白可以是LTB蛋白-STa蛋白-STb蛋白，或者LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-STb蛋白，LTB蛋白-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白。优选，在所述三个基因序列之间有柔性连接序列。例如，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-STb蛋白，LTB蛋白-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白。在本专利技术的一个实施例中，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGG。在本专利技术的另一个实施例中，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为DPRVPSS，柔性连接序列2的氨基酸序列为DPRIPSS。根据本专利技术，所述混合抗原中，三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛的质量比为1:5～5:1，优选为1:2～2:1，例如1:1。根据本专利技术，所述混合抗原中进一步含有K88全菌灭活苗。在本专利技术的一种实施方式中，所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.25-0.75mg，K88天然菌毛0.25-0.75mg，任选进一步含有K88全菌灭活苗1.0×109-5.0×109cfu。优选，所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.5mg，K88天然菌毛0.5mg，任选进一步含有K88全菌灭活苗2.5×109cfu。根据本专利技术，混合抗原的免疫用量为：三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg；K88天然菌毛为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg。当混合抗原中进一步含有K88全菌灭活苗时，则K88全菌灭活苗的免疫用量为每只鸡每次1.0×109-5.0×109cfu，优选为2.5×109cfu。根据本专利技术，将混合抗原和佐剂混合免疫蛋鸡，所述佐剂可以是本领域已知的各类佐剂，包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、CpG等。在本专利技术的一个实施方式中，所述佐剂是弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，混合抗原和弗氏完全佐剂的体积比为2:1～1:2，优选为1:1；混合抗原和弗氏不完全佐剂的体积比为2:1～1:2，优选为1:1。根据本专利技术，蛋鸡的免疫程序为三次免疫，首次免疫后第2-4周进行第二次免疫，首次免疫后第4-6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体，其特征在于，以混合抗原免疫蛋鸡获得的卵黄抗体，所述混合抗原包含三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛；所述三价肠毒素融合蛋白是LTB蛋白、STa蛋白和STb蛋白顺序连接组成的融合蛋白，在所述三个蛋白之间存在柔性连接序列；优选，所述融合蛋白是LTB蛋白‑柔性连接序列1‑STa蛋白‑柔性连接序列1‑STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGG；或者，所述融合蛋白是LTB蛋白‑柔性连接序列1‑STa蛋白‑柔性连接序列2‑STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为DPRVPSS，柔性连接序列2的氨基酸序列为DPRIPSS；优选，所述混合抗原进一步含有K88全菌灭活苗。

【技术特征摘要】
1.一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体，其特征在于，以混合抗原免疫蛋鸡获得的卵黄抗体，所述混合抗原包含三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛；所述三价肠毒素融合蛋白是LTB蛋白、STa蛋白和STb蛋白顺序连接组成的融合蛋白，在所述三个蛋白之间存在柔性连接序列；优选，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGG；或者，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为DPRVPSS，柔性连接序列2的氨基酸序列为DPRIPSS；优选，所述混合抗原进一步含有K88全菌灭活苗。2.如权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述混合抗原中，三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛的质量比为1:5～5:1，优选为1:2～2:1；优选，所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.25-0.75mg，K88天然菌毛0.25-0.75mg，任选进一步含有K88全菌灭活苗1.0×109-5.0×109cfu；优选，混合抗原的免疫用量为，三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg；K88天然菌毛为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg；任选进一步含有K88全菌灭活苗时，K88全菌灭活苗为每只鸡每次1.0×109-5.0×109cfu，优选为2.5×109cfu；优选，将混合抗原和佐剂混合免疫蛋鸡，所述佐剂是弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，混合抗原和弗氏完全佐剂的体积比为2:1～1:2，优选为1:1；混合抗原和弗氏不完全佐剂的体积比为2:1～1:2，优选为1:1；优选，蛋鸡的免疫程序为三次免疫，首次免疫后第2-4周进行第二次免疫，首次免疫后第4-6周进行第三次免疫；优选，分别在第0、3、5周进行免疫，或者分别在第0、2、6周进行免疫；优选，首次免疫时，使用混合抗原和弗氏完全佐剂，第二次和第三次免疫使用混合抗原和弗氏不完全佐剂。3.一种抗猪产肠毒素大肠杆菌的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，以混合抗原免疫蛋鸡，获得卵黄抗体，所述混合抗原包含三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛；所述三价肠毒素融合蛋白是LTB蛋白、STa蛋白和STb蛋白顺序连接组成的融合蛋白，在所述三个蛋白之间存在柔性连接序列；优选，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列1-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为SGGGGSGGGGSGGGG；或者，所述融合蛋白是LTB蛋白-柔性连接序列1-STa蛋白-柔性连接序列2-STb蛋白，所述柔性连接序列1的氨基酸序列为DPRVPSS，柔性连接序列2的氨基酸序列为DPRIPSS；优选，所述混合抗原进一步含有K88全菌灭活苗。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述混合抗原中，三价肠毒素融合蛋白和K88天然菌毛的质量比为1:5～5:1，优选为1:2～2:1；优选，所述混合抗原以液体形式存在，其中，每毫升含有三价肠毒素融合蛋白0.25-0.75mg，K88天然菌毛0.25-0.75mg，任选进一步含有K88全菌灭活苗1.0×109-5.0×109cfu；优选，混合抗原的免疫用量为，三价肠毒素融合蛋白为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg；K88天然菌毛为每只鸡每次0.25-0.75mg，优选为0.5mg；任选进一步含有K88全菌灭活苗时，K88全菌灭活苗为每只鸡每次1.0×109-5.0×109cfu，优选为2.5×109cfu；优选，将混合抗原和佐剂混合免疫蛋鸡，所述佐剂是弗氏完全佐剂或弗氏不完全...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺平丽，韩帅娟，杨丰帆，杨砚，谯仕彦，李德发，
申请(专利权)人：湖北神地农业科贸有限公司，湖北神地生物科技有限公司，湖北神地汇丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42