大肠杆菌O157:H7的CPA引物及试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌O157:H7的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法，该针对靶点rfbE设计的CPA引物包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.5所示。本发明专利技术中所提供的针对E.coliO157:H7特异性靶序列rfbE及stx1所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列rfbE及stx1的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交叉引物恒温扩增反应体系，并在60分钟左右获得检测结果以缩短传统大肠杆菌检测的周期。

CPA primers, kits and detection methods of Escherichia coli O157:H7

The present invention discloses a CPA primer of E. coli O157:H7 and its detection kit and detection method. The CPA primer designed for target rfbE includes peeled primer 4s, 5a, cross-amplified primer 2a1s, and specific primers 2a and 3a. Its nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1_SEQ ID NO.5, respectively. The cross-primer constant temperature amplification reaction detection and identification system designed for E.coliO157:H7 specific target sequence rfbE and stx1 in the invention solves the shortcomings of the existing technical methods, such as long cycle, low sensitivity, high cost and difficult field application. By selecting the conservative regions of rfbE and stx1, a pair of peeled primers, cross primers and specific primers were designed to construct a cross primer constant temperature amplification reaction system. The detection results were obtained in about 60 minutes to shorten the detection cycle of traditional E. coli.

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌O157:H7的CPA引物及试剂盒和检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种大肠杆菌O157:H7的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
目前微生物的检测鉴定方法主要分为培养鉴定法、免疫检测法及核酸检测。培养鉴定法及免疫检测法操作繁琐、实验周期长，对实验人员专业水平要求高。交叉引物恒温扩增(CrossingPrimingAmplification,CPA)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但该反应引物设计难度较高，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。EscherichiacoliO157:H7是肠出血大肠杆菌最重要的血清型，是一种人畜共患的肠道致病菌，主要通过污染的动物源性食品感染人类，如生的或绞碎的肉制品、生牛奶和受污染的蔬菜和芽菜向人类传播，感染人体后表现为相应的临床症状。轻度感染可引起腹部绞痛和腹泻，发烧和呕吐也可能出现。重度感染则表现为出血性结肠炎，溶血性尿毒综合征。目前由E.coliO157:H7感染引起的食源性疾病已经成为世界性的卫生问题。而在E.coliO157:H7中存在部分可以产志贺毒素I型的大肠杆菌。若发生感染可导致人类出现腹泻、出血性结肠炎等一些胃肠道疾病。志贺毒素I型在肠腔产生后，可穿过上皮细胞进入血循环，引起特定靶组织的血管损伤，如脑、肾血管损伤。产志贺毒素大肠杆菌具有强烈的致病性和致死性等特点，严重威胁人类的生命健康，已成为世界性的公共卫生问题。中国专利申请CN108796098A公开了一种PSR等温扩增反应检测大肠杆菌志贺毒素的引物、试剂盒及其方法，该专利针对志贺毒素特异性靶序列stx2设计了PSR反应的引物用于检测。中国专利申请CN108796099A公开了一种大肠杆菌O157:H7的PSR检测引物、试剂盒及其检测方法，该专利针对大肠杆菌O157:H7的特异性靶序列rfbE设计了PSR反应的引物用于检测。以上专利中的反应灵敏度最小单位为pg/μL，灵敏度不够高，限制了适用范围。
技术实现思路
为了克服PSR反应检测灵敏度低的问题，本专利技术的首要目的在于一种大肠杆菌O157:H7的CPA引物，其灵敏度达到了fg/μL，是PSR反应灵敏度的100～1000倍，能够解决现有技术灵敏度较低的问题。本专利技术的另一目的在于提供一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用的特点。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测引物，是针对其靶点rfbE设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点rfbE剥离引物4s：5’-aggaccgcagaggaaaga-3’(SEQIDNO.1)；靶点rfbE剥离引物5a：5’-tccacgccaaccaagatc-3’(SEQIDNO.2)；靶点rfbE交叉引物2a1s：5’-agtacattggcatcgtgtcagataaactcatcgaaaca-3’(SEQIDNO.3)；靶点rfbE特异引物2a：5’-agtacattggcatcgtgt-3’(SEQIDNO.4)；靶点rfbE特异引物3a：5’-ggcatcgtgtggacagggt-3’(SEQIDNO.5)。一种大肠杆菌志贺毒素I型的CPA检测引物，是针对其靶点stx1设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点stx1剥离引物4s：5’-agttgatgtcagagggatag-3’(SEQIDNO.6)；靶点stx1剥离引物5a：5’-cgctgttgtacctggaaa-3’(SEQIDNO.7)；靶点stx1交叉引物2a1s：5’-atcagcaaagcgataaaactacggcttattgttgaa-3’(SEQIDNO.8)；靶点stx1特异引物2a：5’-atcagcaaagcgataaaa-3’(SEQIDNO.9)；靶点stx1特异引物3a：5’-cctgttaacaaatcctgtcac-3’(SEQIDNO.10)。一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测试剂盒，包括上述的大肠杆菌O157:H7的CPA检测引物和/或大肠杆菌志贺毒素I型的CPA检测引物；所述试剂盒中，各CPA检测引物的浓度优选10μM；所述的试剂盒还包括如下组分：A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs(each)；B、BstDNA聚合酶；C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液；组分B中所述的BstDNA聚合酶优选浓度为8U/μL的BstDNA聚合酶水溶液。组分C中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制50μM的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mM的氯化锰水溶液；(ii)取25μL50μM的钙黄绿素溶液与10μL1mM的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测方法，包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8～2.0；(2)分别建立检测rfbE和/或stx1的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟终止反应；其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的BstDNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；最后加入1μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；(3)针对靶点rfbE的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色，如颜色为黄色，说明待检样品中不含有大肠杆菌O157:H7；如颜色变为绿色，说明待检样品中含有大肠杆菌O157:H7；(4)针对靶点stx1的检测，终止反应后对扩增产物做琼脂糖凝胶电泳，呈现梯形条带的含有大肠杆菌志贺毒素I型，无扩增条带的不含有大肠杆菌志贺毒素I型。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术中所提供的针对E.coliO157:H7特异性靶序列rfbE及stx1所设计的交叉引物恒温扩增反应检测鉴定体系，解决现有技术方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场应用困难等缺陷。通过选择目标菌株的特异性序列rfbE及stx1的保守区域，设计一对剥离引物、交叉引物和特异引物构建交本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测引物，其特征在于：是针对靶点rfbE设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点rfbE剥离引物4s：5’‑aggaccgcagaggaaaga‑3’(SEQ ID NO.1)；靶点rfbE剥离引物5a：5’‑tccacgccaaccaagatc‑3’(SEQ ID NO.2)；靶点rfbE交叉引物2a1s：5’‑agtacattggcatcgtgtcagataaactcatcgaaaca‑3’(SEQ ID NO.3)；靶点rfbE特异引物2a：5’‑agtacattggcatcgtgt‑3’(SEQ ID NO.4)；靶点rfbE特异引物3a：5’‑ggcatcgtgtggacagggt‑3’(SEQ ID NO.5)。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测引物，其特征在于：是针对靶点rfbE设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点rfbE剥离引物4s：5’-aggaccgcagaggaaaga-3’(SEQIDNO.1)；靶点rfbE剥离引物5a：5’-tccacgccaaccaagatc-3’(SEQIDNO.2)；靶点rfbE交叉引物2a1s：5’-agtacattggcatcgtgtcagataaactcatcgaaaca-3’(SEQIDNO.3)；靶点rfbE特异引物2a：5’-agtacattggcatcgtgt-3’(SEQIDNO.4)；靶点rfbE特异引物3a：5’-ggcatcgtgtggacagggt-3’(SEQIDNO.5)。2.一种大肠杆菌志贺毒素I型的CPA检测引物，其特征在于：是针对靶点stx1设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点stx1剥离引物4s：5’-agttgatgtcagagggatag-3’(SEQIDNO.6)；靶点stx1剥离引物5a：5’-cgctgttgtacctggaaa-3’(SEQIDNO.7)；靶点stx1交叉引物2a1s：5’-atcagcaaagcgataaaactacggcttattgttgaa-3’(SEQIDNO.8)；靶点stx1特异引物2a：5’-atcagcaaagcgataaaa-3’(SEQIDNO.9)；靶点stx1特异引物3a：5’-cctgttaacaaatcctgtcac-3’(SEQIDNO.10)。3.一种大肠杆菌O157:H7的CPA检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的CPA检测引物和/或权利要求2所述的CPA检测引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：各CPA检测引物的浓度为10μM。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还包括如下组分：A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振波，骆玉婷，刘君彦，张桂兰，苗健，袁牧，陈玲，苏健裕，李冰，李琳，李晓玺，张霞，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44