用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法。本发明专利技术针对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:‑新筛选2个VNTR位点，并联用已知的5个VNTR位点，建立MLVA‑2位点法和MLVA‑7位点法。经过大量鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:‑菌株检测验证，本发明专利技术的检测分析方法可直接对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:‑进行稳定的分型检测，仅分析2个基因，分型效率与传统的MLST分型方法相当，仅分析7个基因，分型效率高于联用原有MLST和MLVA‑5位点分型方法。

VNTR loci, primers and detection methods for typing Salmonella typhimurium or its single-phase strains

The invention discloses a VNTR locus, a detection primer group and a detection analysis method for typing Salmonella typhimurium or its single-phase bacteria. The present invention screens two new VNTR loci for Salmonella typhimurium and its single-phase strain Salmonella typhimurium 1,4, [5], 12:i:and establishes MLVA_2 locus method and MLVA_7 locus method by combining five known VNTR loci. After a large number of detection and verification of Salmonella typhimurium and its single-phase strain Salmonella typhimurium 1,4, [5], 12:i:, the detection and analysis method of the present invention can directly detect Salmonella typhimurium and its single-phase strain Salmonella typhimurium 1,4, [5], 12:i:, and carry out stable typing detection. Only two genes are analyzed, and the typing efficiency is comparable to that of the traditional MLST typing method, only seven genes are analyzed, and the typing efficiency is higher than that of the linkage method. The original MLST and MLVA 5 locus typing methods were used.

【技术实现步骤摘要】
用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法
：本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法。
技术介绍
：沙门菌(Salmonellaspp)是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病病原菌，可引起人和动物的伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症等许多严重疾病，使全球遭受巨大的经济损失。目前，全世界已发现约2610种沙门菌血清型。其中，鼠伤寒沙门菌(Salmonellaentericasubsp.entericaserovarTyphimurium，STM)是存在于畜禽及食品中的优势血清型，也是引起人类感染的主要血清型。21世纪以来，一种新出现的高致病性血清型——沙门菌1,4,[5],12:i:-，在多个国家不断被检出，并引起食源性疾病暴发流行。沙门菌1,4,[5],12:i:-与鼠伤寒沙门菌(抗原式：1,4,[5],12:i:1,2)具有相似抗原形式，两者的区别在于沙门菌1,4,[5],12:i:-缺失了第Ⅱ相鞭毛抗原。多项研究显示沙门菌1,4,[5],12:i:-与鼠伤寒沙门菌具有很高的遗传相似度，是鼠伤寒沙门菌的单相菌变种。采用有效的分型方法对不同来源、不同血清型甚至不同致病力的沙门菌加以区分，对沙门菌危害溯源、风险预警和疫情监测具有重要意义。分子分型即使用不同的分子技术反映致病菌基因组DNA序列差异的方法，具有稳定、准确、快速、分辨力高和操作性强等优点。一些常用的基于核酸序列的分子分型方法，如多位点序列分型(Multilocussequencetyping,MLST)和多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple-locusvariable-numbertandem-repeatanalysis，MLVA)，准确、重复性好，实现了数据交换和共享，使得不同实验室间的结果具有可比性，在病原菌的追溯、传播链的确认、新的流行菌株的发现、系统发生分析甚至于疫情的预警预报等方面发挥了重要作用。MLST分型是通过分析沙门菌基因组上相对保守的7个管家基因(arcC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA)，借助DNA测序技术及BLAST比对技术得到管家基因的等位基因，根据碱基突变揭露致病菌基因谱的改变。7个管家基因的等位基因型组成一个等位基因谱，每个等位基因谱对应唯一一个序列型，即ST型(Sequencetype，ST)。研究显示，MLST分型方法将鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-菌株分为两大簇，称作eBGs(eBurstGroups)，一大簇是由ST19、ST34等主要型别菌株组成的eBG1簇，另一簇是由ST36型菌株组成的eBG138簇(见图1)。而鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-血清型目前仅发现具有存在于eBG1簇的ST19、ST34，以及eBG138簇的ST36三种型别的菌株(见图1)。MLVA分型方法是利用微生物基因组中不同位点串联重复序列(Variable-numbertandem-repeat，VNTR)数目的不同，对其进行分型，被广泛用于微生物，尤其是细菌的研究。MLVA方法操作简单、快速、分辨率高。2004年Lindstedt等利用鼠伤寒沙门菌的5个VNTR位点-STTR9、STTR5、STTR6、STTR10、STTR3成功建立了用于鼠伤寒沙门菌的MLVA-5位点分型方法，该方法大大提高了对鼠伤寒沙门菌多态性的分辨能力。基于7个管家基因的MLST方法，其ST型不仅可以判断沙门菌菌株之间的亲缘关系，还与沙门菌血清型具有对应关系，相比于MLST方法，MLVA提供一种分辨率更高的分型效果，因此，联合应用MLST和MLVA两种分型方法对沙门菌进行分型，对沙门菌危害溯源、风险预警和疫情监测具有重要意义。在实际工作中，如果分别采用MLST和MLVA两种分型方法对鼠伤寒沙门菌分型，共要分析12个基因的核酸序列，工作量大，耗时长、费用高。
技术实现思路
：本专利技术的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种更有效、更简便、高分辨率的用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种分型检测的VNTR位点、检测引物组及检测分析方法。针对上述问题，本专利技术在实际工作中筛选到两个新的VNTR位点——STMV1和STMV2，针对这两个位点设计特异性核苷酸引物序列，建立MLVA-2位点法对鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-进行分型，其分型结果与MLST分型方法中的菌株ST型具有一定的相关性。MLVA-2位点法应用于鼠伤寒沙门菌时，eBG138簇ST36型菌株的STMV1位点的重复数全部为8，同时，eBG1簇的ST19、ST34、ST313、ST213、ST128、ST568和ST302等型别菌株的STMV1位点的重复数全部为9。联合STMV2位点，eBG1簇的ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2的重复数全部为4，eBG1簇的ST19、ST313、ST213、ST128、ST568和ST302型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为3。对于分为eBG1和eBG138两大簇和具有众多MLST型别的鼠伤寒沙门菌，STMV1和STMV2可以鉴别eBG1和eBG138两簇菌株，以及eBG1簇中的ST34型菌株。MLVA-2位点法应用于仅具有ST19、ST34、ST36三种型别菌株的鼠伤寒单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-，eBG138簇的ST36型菌株的STMV1位点的重复数全部为8，同时，eBG1簇的ST19、ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9。联合STMV2位点，eBG1簇的ST34型菌株的STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为4，eBG1簇的ST19型菌株STMV1位点的重复数全部为9和STMV2位点的重复数全部为3。进一步联用7个VNTR位点STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10、STTR3的引物组合，建立一种鼠伤寒沙门菌及其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型新方法——MLVA-7位点法，提高分型效率。根据各位点PCR扩增片段测序结果中每一个位点重复序列的数目进行分型，结果表示为n-n-n-n-n-n-n。因此，本专利技术的第一个目的是提供一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的VNTR位点，所述的VNTR位点编号为STMV1和STMV2；所述的STMV1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的STMV2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的检测引物组，由下列引物组成：针对STMV1位点：STMV1-F：5’-GCAAAAGCAGGCTGAAG-3’(如SEQIDNO.8所示)，STMV1-R：5’-GGCGCATTCTTACCCGAG-3’(如SEQIDNO.9所示)；针对STMV2位点：STMV2-F：5’-CGTGATGCTCTGATTTTGCT-3’(如SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:‑分型检测的VNTR位点，其特征在于，所述的VNTR位点编号为STMV1和STMV2；所述的STMV1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的STMV2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的VNTR位点，其特征在于，所述的VNTR位点编号为STMV1和STMV2；所述的STMV1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的STMV2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：针对STMV1位点：STMV1-F：5’-GCAAAAGCAGGCTGAAG-3’，STMV1-R：5’-GGCGCATTCTTACCCGAG-3’；针对STMV2位点：STMV2-F：5’-CGTGATGCTCTGATTTTGCT-3’，STMV2-R：5’-CCGTAAGCGGGAATCGTA-3’。3.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的VNTR位点，其特征在于，所述的VNTR位点编号为STMV1、STMV2、STTR9、STTR5、STTR6、STTR10和STTR3；所述的STMV1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的STMV2的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述的STTR9的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述的STTR5的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述的STTR6的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述的STTR10的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述的STTR3的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。4.一种用于鼠伤寒沙门菌或其单相菌变种沙门菌1,4,[5],12:i:-分型检测的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：针对STMV1位点：STMV1-F：5’-GCAAAAGCAGGCTGAAG-3’，STMV1-R：5’-GGCGCATTCTTACCCGAG-3’；针对STMV2位点：STMV2-F：5’-CGTGATGCTCTGATTTTGCT-3’，STMV2-R：5’-CCGTAAGCGGGAATCGTA-3’；针对STTR9位点：STTR9-F：5’-AGAGGCGCTGCGATTGACGATA-3’，STTR9-R：5’-CATTTTCCACAGCGGCAGTTTTTC-3’；针对STTR5位点：STTR5-F：5’-ATGGCGAGGCGAGCAGCAGT-3’，STTR5-R：5’-GGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨小鹃，吴清平，张菊梅，吴诗，黄嘉慧，曾海燕，丁郁，雷涛，庞锐，古其会，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44