一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法技术

本发明专利技术公开了一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法。本发明专利技术提供了用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌Escherichia coli（DH5α‑LNSF1），该工程菌于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCC No.60445。使用该基因工程菌可高效生产屎肠球菌GAD固定化酶，其方法为利用改性甲壳素亲和吸附CBM‑GAD融合酶粗酶液，即可获得屎肠球菌GAD固定化酶。该方法使用的改性甲壳素与CBM‑GAD融合酶的亲和性强、结合牢固，得到的GAD固定化酶活力和稳定性高，解决了GAD固定化难、半衰期短、成本高的问题；另外，该固定化方法快捷、效率高，成本大大降低，在高效生产屎肠球菌GAD固定化酶的工业化生产方面具有广泛的应用前景。

Immobilization of Enterococcus faecium glutamate decarboxylase by a genetically engineered strain and its immobilization method

The invention discloses a genetically engineered bacterium for efficient immobilization of glutamate decarboxylase of Enterococcus faecium and an immobilization method thereof. The invention provides Escherichia coli (DH5alpha LNSF1), a genetic engineering bacterium for GAD immobilization of Enterococcus faecium, which is stored in Guangdong Microbial Species Preservation Center on September 18, 2018, and its storage number is GDMCC No. 60445. The GAD immobilized enzyme of Enterococcus faecium can be efficiently produced by using the genetic engineering bacteria. The method is to obtain the GAD immobilized enzyme of Enterococcus faecium by adsorbing CBM GAD fusion enzyme crude enzyme solution with modified chitin affinity. The method uses modified chitin with CBM GAD fusion enzyme which has strong affinity and strong binding. The GAD immobilized enzyme obtained has high activity and stability, and solves the problems of difficult immobilization, short half-life and high cost of GAD. In addition, the immobilization method is fast, efficient and cost-effective, and has a wide range of industrial production of GAD immobilized enzyme of Enterococcus faecium. Application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法
本专利技术属于食品生物
，更具体地，涉及一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法。
技术介绍
谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)专一地催化L-谷氨酸(L-glutamicacid,L-Glu)α-羧基发生脱羧作用，在γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)生物合成和手性物质DL-谷氨酸(DL-glutamicacid，DL-Glu)的拆分方面具有重要应用(BrazilianJournalofMicrobiology,2012,43(4):1230-1241；AminoAcids,2016,48(11):2519-2531；化学与生物工程,2013,30(11):55-56.)。由于乳酸菌具有较好的安全性，便于在发酵食品中应用，乳酸菌GAD受到了极大关注，已发现短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)(LWT-FoodSciTechnol,2016,67:22-26)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)(FoodMicrobiol2005,22:497-504)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)(BrazJMicrobiol2013；44:183-187)、清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)(JMicrobiolBiotechnol2015；25:696-703)、唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivariusssp.thermophilus)(食品科学,2011,32(1):162-167)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)(湖北农业科学,2010,49(6):1450-1453)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)(食品科学,2018,39(4):90-98)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)(MicrobiolBiotechnolLett,2015,43:300-305)等微生物均具有GAD。然而，由于野生株GAD主要为了满足微生物抗酸机制的需要，表达量普遍不高，GAD活力低，同时游离酶难以回收，无法重复利用和连续化生产，因此应用成本高居高不下，难于满足GABA或DL-Glu工业化生产需要。由于固定化酶易于实现酶与反应液的分离、稳定酶的活性，便于酶的重复使用，降低生产成本，因此，固定化酶在工业生物催化领域备受关注。目前对GAD固定化主要集中在两个方面：①对具GAD的野生株细胞进行固定化；例如，黄俊用海藻酸钙胶珠对具有GAD活力的短乳杆菌细胞进行了固定化(浙江大学博士学位论文，2006)。②对重组GAD进行固定化：主要通过基因工程菌表达高活力GAD，再对GAD粗酶进行固定化；例如，朱菲用聚乙烯醇-海藻酸钠、Ni-NTA对重组短乳杆菌GAD的固定化进行了研究(浙江大学硕士学位论文，2011)；Lee等将大肠杆菌GAD与组氨酸标签融合表达，用镍螯合树脂固定重组酶，固定化酶重复使用10次仍可保留58％的初始活力(InternationalJournalofMolecularSciences,2013,14(1):1728-1739)。但是，已报道的固定化方法普遍存在固定化载体成本较高、操作繁琐、半衰期短、活力不高等问题，特别是很多固定化方法制备的固定化酶不是纯酶(如固定化细胞)，无法克服下游代谢酶或杂蛋白的影响。因此，仍亟需探寻便捷、稳定性高、成本低、酶纯度高的固定化方法。采用基因工程技术克隆目的酶基因与亲和标签构建融合酶表达载体，转化到大肠杆菌、酵母等表达系统中进行表达，然后利用亲和载体固定化融合酶，是一种高效固定化酶的新技术。如能科学设计，构建和高效表达带亲和标记融合酶，并探寻出价格低廉、来源丰富的不溶性载体，然后利用融合酶的亲和标签与不溶性载体的强亲和力制备固定化酶，将具有很好的理论和实践意义。大多数纤维素降解酶包含三个结构域：纤维素结合结构域(cellulose-bindingdomain，CBD)、柔性连接区域和催化结构域(JBiolChem,1992,267:6743-6749；JBacteriol,1993,175:5762-5768；BioresourTechnol,2011,102:2910-2915)。纤维素相对便宜，化学惰性，对大多数蛋白质具有较低非特异性亲和力，在商业上可以以多种不同的形式存在。因此，利用CBD的纤维素结合模块(cellulose-bindingmodule，CBM)可以与纤维素特异和不可逆的结合的特性，可将CBM开发为亲和标签，构建融合蛋白，与纤维素发生亲和吸附制备固定化酶(IntJMolSci,2012,13:358-368；BiotechnolProg,2009,25:68-74；JIndMicrobiolBiotechnol,2008,35:1455-1463)。虽然，在理论上可借鉴CBM亲和标签在其他酶上的应用的思路，然而由于不同酶的结构和基因差异性很大，在CBM-融合酶的构建和高效表达方面尚无可直接复制方法，CBM-融合酶能否高效表达、表达成本和安全性等诸多因素仍是制约该项技术发展的关键和瓶颈。与其他基因工程菌的研究和开发一样，CBM-融合酶的构建和表达也需要针对个案进行科学设计和构建，才能获得有益效果。不同来源的GAD在结构上存在巨大差异，即使同属微生物，不同菌株的GAD的亚基组成和分子量等方面都具有巨大差异。例如，EscherichiacoliGAD含有6个相同的亚基，分子量为53kDa(Biochemistry,1970,9(2):226-232)；肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)GAD与哺乳动物GAD65亚基分子量(54kDa)和序列相似(59％相似，28％一致)(FEMSMicrobiolLett,1995,133(1-2):113-138)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)GAD亚基的测定分子量约为33kDa，动力学性质与E.coliGAD相似(TheJournalOfBiologicalChemistry,1991,266(8):5135-5139)；产气荚膜杆菌(Clostridiumperfringens)GAD分子量为290kDa(BiochemJ,1970,118:135-141)；短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)GAD有两个亚基，亚基分子量为60kDa(BiosciBiotechBiochem,1997,61(7):1168-1171)；乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis)的GAD只有一个亚基，亚基分子量大约为54kDa(Microbiology,1999,145:1375-1380)，然而虽然乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)SYFS1.009的GAD同样也只有一个亚基，但是亚基分子量为65kDa(许建军，博士学位论文，江南大学，2004年2月)，说明即使同种微生物的不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌为

【技术特征摘要】
1.一株用于屎肠球菌GAD高效固定化的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌为Escherichiacoli（DH5α-LNSF1），该工程菌于2018年9月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：GDMCCNo.60445。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为：含有由胁迫诱导型启动子PrpoS、CBM编码序列cbm3、EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB和T7终止子序列重组构建而成的pRPOCB-efagadB重组质粒。3.一种构建权利要求1或2所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.克隆EnterococcusfaeciumLNSF2的GAD基因gadB；S2.构建包含胁迫诱导型启动子PrpoS、纤维素结合模块CBM编码序列cbm3和T7终止子序列的大肠杆菌pRPOCB表达载体；S3.采用屎肠球菌gadB基因与pRPOCB表达载体构建重组质粒pRPOCB-efagadB；S4.将重组质粒pRPOCB-efagadB转化大肠杆菌的感受态细胞，构建表达CBM-GAD融合酶的工程菌Escherichiacoli（DH5α-LNSF1）；其中，CBM为纤维素结合模块，GAD为谷氨酸脱羧酶。4.权利要求1或2所述基因工程菌Escherichiacol...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨胜远，韦锦，
申请(专利权)人：岭南师范学院，
类型：发明
国别省市：广东,44