一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。所述shRNA为pSicoR‑shRNA‑508，由siRNA正义链、loop环、siRNA反义链和终止信号组成。所述shRNA能有效稳定地抑制兔Deptor基因的表达，可通过抑制Deptor基因表达探讨其对外源目的基因表达效率的影响及其作用机理，进一步验证Deptor基因对兔胚胎干细胞多能性维持和自噬通路相关基因表达的影响，为兔胚胎干细胞稳定建系奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种抑制兔Deptor基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
Deptor是一个来源于DEPDC6基因(NCBIgeneID64798)的48kDa蛋白质。Peterson等人在mTOR的免疫沉淀中鉴定出了此蛋白，因此蛋白N末端串联了两个DEP结构域，又与mTOR有相互作用，于是将其蛋白命名为Deptor。Deptor的C末端含有PDZ结构域，调节Deptor与mTOR蛋白质的C端区域的互作作用。Deptor是mTOR复合物mTORC1/2的组成成分，并对这两个复合物起负调控作用。干扰Deptor的表达，mTORC1/2下游信号传导底物的磷酸化增加，相反，Deptor的过表达抑制mTORC1/2下游的信号传导。在缺乏生长因子或存在mTOR抑制剂的情况下，mTOR-Deptor的结合被强化，从而降低mTOR活性。另外，Deptor也是一种磷酸化蛋白，可以进行翻译后修饰，从而影响其与mTOR的结合。在生长因子的刺激下，激活的RSK1和S6K1会使Deptor磷酸化，磷酸化的Deptor会被泛素蛋白酶体系统迅速降解，从而提高mTOR的活性。在生物体内，Deptor主要在内分泌腺表达。在癌症上，Deptor在不同的组织或细胞中，可以表现为致癌基因或抑癌基因。在大多数癌症中Deptor表达量低，但在多发性骨髓瘤亚群中表达量高，在这些细胞中，Deptor的高表达对维持PI3K和AKT活化是必要的，Deptor表达水平降低将导致细胞凋亡。Deptor作为天然的mTOR抑制剂，通过调节细胞自噬相关通路调节细胞生长、凋亡、自噬和内质网应激。近年，有报道称Deptor能作为一个核蛋白与DNA结合，调控基因的转录。Deptor能调节内质网内稳态相关基因转录，其下调则会促进内质网应激的发生，诱导凋亡产生。近年有报道，mTOR复合物中的Deptor不仅仅定义为mTOR的抑制剂。Deptor可能作为一个干细胞因子，与其他多能因子组成干细胞调控自噬网络，直接参与多能干细胞的干性。对Deptor基因启动子进行预测，发现启动子区含有Oct4结合的区域，也含Sox2结合区域，推测Deptor可能受Oct4、Sox2调控。依据前人的报道，mTOR通路对干细胞多能性的维持有重要作用，而mTOR复合物中Deptor是mTOR天然抑制因子，同时也被报道为潜在的干细胞因子。由此，推测Deptor对干细胞的多能性具有调节作用。因此，有必要进一步研究Deptor基因对兔胚胎干细胞(RabbitEmbryonicStemCells，rbESCs)多能性的影响，为rbESCs建系和丰富多能性调控网络奠定基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能有效稳定地抑制兔Deptor基因表达的shRNA，可通过抑制Deptor基因表达探讨其对外源目的基因表达效率的影响及其作用机理。本专利技术的目的在于提供一种shRNA。本专利技术的另一目的在于提供一种含有上述shRNA的重组慢病毒表达载体。本专利技术的另一目的在于提供上述重组慢病毒表达载体的构建方法。本专利技术的另一目的在于提供一种慢病毒颗粒。本专利技术的另一目的在于提供一种基因工程化的兔胚胎干细胞。本专利技术的另一目的在于提供上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在抑制兔Deptor基因表达中的应用。本专利技术的另一目的在于提供上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在维持rbESCs多能性中的应用。本专利技术的另一目的在于提供上述shRNA、重组慢病毒表达载体、慢病毒颗粒和/或兔胚胎干细胞在调控自噬通路相关基因表达中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：本专利技术人利用分子和细胞生物学技术，首先克隆得到兔Deptor基因全长序列，构建了兔Deptor基因融合蛋白表达载体，设计合成了兔Deptor基因shRNA片段并构建其慢病毒表达载体。然后，采用脂质体转染方式将兔Deptor基因融合蛋白表达质粒和其shRNA慢病毒表达载体共转入HEK293T细胞，收集细胞检测兔Deptor基因在293T细胞中的表达，快速筛选获得高效抑制兔Deptor基因的shRNA干扰序列，通过慢病毒感染法将其导入rbESCs，观察细胞形态变化并收集细胞检测与多能性及自噬通路相关基因的表达情况。因此，本专利技术请求保护一种shRNA，所述shRNA为pSicoR-shRNA-508，由19nt的siRNA正义链、9nt的loop环、19nt的siRNA反义链和终止信号组成；所述siRNA正义链的碱基序列如SEQIDNO:1所示；所述siRNA反义链的碱基序列如SEQIDNO:2所示；所述loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；所述终止信号的碱基序列为TTTTTT。siRNA正义链(SEQIDNO:1)：AACGCGTCTGAATTCCTTGATTGGTTCAAGAGACCAATCAAGGAATTCAGACGCTTTTTTCsiRNA反义链(SEQIDNO:2)：TCGAGAAAAAAGCGTCTGAATTCCTTGATTGGTCTCTTGAACCAATCAAGGAATTCAGACGCGTT本专利技术还请求保护一种含有上述shRNA的重组慢病毒表达载体。所述重组慢病毒表达载体的构建方法是将上述shRNA插入慢病毒表达载体的酶切位点HpaI和XhoI之间得到。优选地，所述慢病毒表达载体为pSicoR-Ef1a-mCh质粒。本专利技术还请求保护一种慢病毒颗粒，是将上述重组慢病毒表达载体与包装质粒NRF、包膜质粒pCMV-VSV-G共转染宿主细胞HEK293T后得到，其病毒滴度为8×106。本专利技术还请求保护一种基因工程化的兔胚胎干细胞，是将上述慢病毒颗粒转染兔胚胎干细胞后得到。本专利技术进行了以下具体研究工作，以探究抑制Deptor基因对兔胚胎干细胞多能性维持和自噬通路相关基因表达的影响：(1)兔Deptor基因的克隆、融合表达载体的构建及其检测克隆得到兔Deptor基因mRNA的全长序列，经过测序验证序列正确后，将其定向插入pEGFP-N1载体中，构建兔Deptor基因的融合表达载体，酶切验证阳性重组质粒pEGFP-Deptor。重组质粒经脂质体转染方式导入HEK293T细胞，细胞培养72h后，荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，鉴定其能够在HEK293T细胞中表达。(2)shRNA片段设计及其慢病毒表达载体的构建、细胞检测针对兔Deptor基因CDs序列，参照siRNA设计原理，选择3个siRNA序列作为靶位点，BLAST比对确认以上序列与其他基因序列无同源性。将其设计为shRNA结构，shRNA结构包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环(TTCAAGAGA)，19nt的siRNA反义链和终止信号(TTTTTT)，shRNA两端引入酶切位点Hpal、Xhol。分别命名为pSicoR-shRNA-477或pSicoR-shRNA-508或pSicoR-shRNA-585，同时选择一个无关序列(NC)作为阴性对照。合成shRNA序列并克隆到慢病毒表达载体p本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种shRNA，其特征在于，所述shRNA为pSicoR‑shRNA‑508，由siRNA正义链、loop环、siRNA反义链和终止信号组成；所述siRNA正义链的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；所述siRNA反义链的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；所述loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；所述终止信号的碱基序列为TTTTTT。

【技术特征摘要】
1.一种shRNA，其特征在于，所述shRNA为pSicoR-shRNA-508，由siRNA正义链、loop环、siRNA反义链和终止信号组成；所述siRNA正义链的碱基序列如SEQIDNO:1所示；所述siRNA反义链的碱基序列如SEQIDNO:2所示；所述loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；所述终止信号的碱基序列为TTTTTT。2.一种重组慢病毒表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述shRNA。3.权利要求2所述重组慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述重组慢病毒表达载体是将权利要求1所述shRNA插入慢病毒表达载体的酶切位点HpaI和XhoI之间得到。4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pSicoR-Ef1a-mCh质粒。5.一种慢病毒颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓彦飞，农恬颖，陈凤，杨素芳，石德顺，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45