检测IncRNA LNC_004208表达量的试剂在制备胶质瘤诊断试剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测长链非编码RNALNC_004208表达量的试剂在制备脑胶质瘤诊断试剂中的应用。本发明专利技术通过研究发现，LNC_004208在高级别胶质瘤组织中高表达，且与胶质瘤分子标记IDH1突变相关。说明LNC_004208是与脑胶质瘤诊断相关的分子标记，可用于制备脑胶质瘤诊断的制剂，为脑胶质瘤患者的诊断提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

【技术实现步骤摘要】
检测IncRNALNC_004208表达量的试剂在制备胶质瘤诊断试剂中的应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学
，具体涉及一种检测IncRNALNC_004208表达量的试剂在制备胶质瘤诊断试剂中的应用。
技术介绍
脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，约占原发性恶性脑肿瘤的80％,根据欧洲神经肿瘤协会(EANO)统计，全世界脑胶质瘤每年发生率约为6/100,000。脑胶质瘤的治疗方法是世界性的难题，特别是恶性胶质母细胞瘤，即便采取最优治疗方案，患者预后仍旧十分不理想，平均生存期仅13.3-15个月。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是近二十年来出现的一种治疗脑胶质瘤效果较好的新药，经美国FDA批准、美国国立综合癌症网络指南推荐已成为治疗脑胶质瘤的首选化疗药物。TMZ属于新型咪唑嗪类口服抗肿瘤药，易于透过血瘤屏障，其活性产物MTIC通过N3、N7、O6位鸟嘌呤和O3位的腺嘌呤DNA烷基化，发挥细胞毒性作用。由于肿瘤细胞内在的因素或者获得性抗性的出现，脑胶质瘤患者对TMZ治疗逐渐产生了抵抗，肿瘤治疗疗效降低。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)通过转移DNA上异常的O6甲基，从而抑制TMZ介导的DNA损伤，导致胶质瘤细胞TMZ抵抗。最新研究表明，除了MGMT之外，肿瘤细胞表皮生长因子(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)等多种信号通路的异常均参与了TMZ抵抗的发生，然而其具体机制仍未阐明。因此，深入探讨TMZ抵抗发生的分子机制，并采取有效的措施进行干预，将为提高脑胶质瘤的化疗疗效提供重要的新思路。近年来研究发现，不同类别的脑胶质瘤组织中lncRNAs表达谱具有显著差异，脑胶质瘤的发病及预后与lncRNAs的表达和功能失调密切相关。分子病理学在精准医学时代的肿瘤研究与诊治中日益发挥着极其重要的作用。随着肿瘤发生发展机制研究及针对性药物开发与临床应用的飞速进展，肿瘤相关分子病理检测也从组织或者细胞学标本，扩展至液体活检；采用的分析手段也更为灵敏、多层面及高通量，并逐步向智能化迈进。精准分子分型已成为肿瘤诊断、治疗及全程管理过程中不可或缺的环节。特别是跨越肿瘤发生部位、以基因型作为直接靶标的治疗模式的探索与实践，给分子病理学提出了新的要求。本专利技术以lncRNALNC_004208为靶标的脑胶质瘤诊断、预后以及治疗新策略，为研究lncRNAs在脑胶质瘤TMZ抵抗中的分子机制提供新的实验证据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测IncRNALNC_004208表达量的试剂在制备胶质瘤诊断试剂中的应用，该IncRNALNC_004208的序列如SEQNO:1所示。所述的检测IncRNALNC_004208表达量的试剂用于检测脑胶质瘤组织。所述的检测IncRNALNC_004208表达量的试剂用于制备诊断高级别脑胶质瘤的试剂。所述的检测IncRNALNC_004208的试剂包括实时荧光定量检测试剂。扩增lncRNALNC_004208的引物包括以下两对或一对：LNC_004208(1)-正向引物5’-GCCAATCCAAACCGAAAGCC-3’，见SEQNO:2；LNC_004208(1)-反向引物5’-AGACTCAGACCCCAGGCTAC-3’，见SEQNO:3；LNC_004208(2)-正向引物5’-TTTGCTACATCCCAGCTCCA-3’，见SEQNO:4；LNC_004208(2)-反向引物5’-TCCCCCTTTCCCTTGTAGGT-3’，见SEQNO:5。检测试剂中用于对照的β-actin正向引物：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，见SEQNO:6。反向引物：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’，见SEQNO:7。试剂中还含有：(1)从脑胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂,包括稳定溶液、试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将RNALNC_004208逆转录为cDNA所用试剂,包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核普酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂,包括实时荧光定量SYBR染料、无酶水。所述的胶质瘤诊断试剂，包括检测IncRNALNC_004208表达量的试剂与胶质瘤分子标记IDH1突变检测试剂。本专利技术通过研究发现，LNC_004208在高级别胶质瘤组织中高表达，且与胶质瘤分子标记IDH1突变相关。说明LNC_004208是与脑胶质瘤诊断相关的分子标记，可用于制备脑胶质瘤诊断的制剂,为脑胶质瘤患者的诊断提供强有力的分子生物学依据,具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。附图说明图1为转录组测序技术和lncRNA测序技术分析TMZ敏感/抗性细胞表达谱；图2为筛选胶质瘤TMZ抵抗细胞中差异表达的lncRNA；图3为筛选并验证胶质瘤TMZ抵抗细胞中差异表达的lncRNA；图4为胶质瘤分级与lncRNA表达的相关性；图5为胶质瘤分子诊断标记物与lncRNA表达的相关性。具体实施方式以下结合具体实施方式进一步说明本专利技术,而非限制本专利技术。实施例1转录组测序技术和lncRNA测序技术分析TMZ敏感/抗性细胞表达谱采用转录组测序技术和lncRNA测序技术(IlluminaHiSeqTM2000)，选取脑胶质瘤T98G/U-118MG细胞系和TMZ抵抗的T98G-R/U-118MG-R细胞系进行表达谱分析。在进行筛选之前，我们首先使用Cuffmerge软件，对各样品拼接得到的转录本进行合并，并去掉其中链方向不确定的转录本，得到本次测序完整的转录组信息。筛选过程分以下5个步骤(图1A)：step1:转录本exon个数筛选：过滤转录组拼接结果中大量低表达量，低可信度的单外显子转录本，选择exon个数>＝2的转录本(如无特殊要求，植物会保留exon个数＝1的转录本)；step2:转录本长度筛选：选择转录本长度>200bp的转录本；step3:转录本已知注释筛选：通过Cuffcompare软件，筛除与数据库注释exon区域有重叠的转录本，并将数据库中，与本次拼接转录本exon区域有重叠的lncRNA作为数据库注释lncRNA纳入到后续分析；step4:转录本表达量筛选：通过Cuffquant计算每条转录本的表达量，选择FPKM>＝0.5的转录本(对于单外显子转录本筛选阈值为2)；step5:编码潜能筛选：分为CNCI,CPC,PFAM,phyloCSF(当物种为非哺乳动物时，不进行phyloCSF分析)。并通过下列软件进行分析(图1B)：CNCI：通过CNCI(Coding-Non-CodingIndex)软件进行的。CNCI能够根据相邻三核苷酸的频谱有效地区分编码和非编码的序列。CNCI可以有效地对不完整的转录本和反义转录本对进行预测；CPC：通过CPC(CodingPotentialCalculator，编码潜能计算)软件进行的。将转录本与已知蛋白数据库做BLAST比对，CPC依据转录本各个编码框的生物学序列特征，通过支持向量机的分类器来评估转录本的编码潜能。十折交叉验证表明CPC能够精确地区分出具有编码能力的转录本；P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测IncRNA LNC_004208表达量的试剂在制备胶质瘤诊断试剂中的应用，该IncRNA LNC_004208的序列如SEQ NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.检测IncRNALNC_004208表达量的试剂在制备胶质瘤诊断试剂中的应用，该IncRNALNC_004208的序列如SEQNO:1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测IncRNALNC_004208表达量的试剂用于检测脑胶质瘤组织。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测IncRNALNC_004208表达量的试剂用于制备诊断高级别脑胶质瘤的试剂。4.根据权利要1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的检测IncRNALNC_004208的试剂包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志杰，颜元良，龚志成，陈曦，霍雷，李学军，曾双双，钱龙，王翔，刘万里，熊小明，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南,43