重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白及其构建方法与引物技术

本发明专利技术属于疫苗制造技术领域。本发明专利技术公开了一种重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白。本发明专利技术还公开了用于构建重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的引物。本发明专利技术又公开了用于重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的构建方法，包括以下步骤：1、构建包含PCV3全基因组的pSK‑sPCV3；2、转移载体的构建；3、穿梭质粒的构建；4、重组杆状病毒的获得；将阳性穿梭质粒Bacmid‑Cap转染Sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组杆状病毒rBac‑Cap。本发明专利技术表达的Cap蛋白具有良好的生物学活性，免疫小鼠发现具有良好的免疫原性。

Recombinant baculovirus expressing porcine circovirus type 3 Cap protein and its construction methods and primers

The invention belongs to the technical field of vaccine manufacturing. The invention discloses a recombinant baculovirus expressing porcine circovirus type 3 Cap protein. The invention also discloses a primer for constructing recombinant baculovirus expressing porcine circovirus type 3 Cap protein. The invention also discloses a method for constructing a recombinant baculovirus expressing Cap protein of porcine circovirus type 3, which comprises the following steps: 1, construction of pSK genome sPCV3 containing PCV3 whole genome; 2, construction of transfer vector; 3, construction of shuttle plasmid; 4, obtaining of recombinant baculovirus; transfection of Sf9 cell with positive shuttle plasmid Bacmid Cap, and obtaining porcine circovirus type 3 Cap gene. Recombinant baculovirus rBac Cap. The CAP protein expressed by the invention has good biological activity and good immunogenicity was found in immunized mice.

【技术实现步骤摘要】
重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白及其构建方法与引物
本专利技术涉及表达猪圆环病毒3型(PCV3)Cap基因的重组杆状病毒的构建方法，用于制造疫苗。
技术介绍
猪圆环病毒病(PCVD)是当前危害养猪业的重要疾病之一，其中PCV2是导致该类疾病的主要致病因子。2016年，Phan等学者报道了新型猪圆环病毒PCV3，该病毒可造成猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪繁殖障碍呼吸系统疾病及消化系统炎症等疾病[PhanTG,GiannittiF,RossowS,etal.DetectionofanovelcircovirusPCV3inpigswithcardiacandmulti-systemicinflammation[J].VirologyJournal,2016,13(1):184.]。通过PCV3全基因组遗传进化分析发现，PCV3与另外PCV1和PCV2两个基因型的病毒处于不同的进化分支，且PCV3各分离株之间也存在进化差异，是新型猪圆环病毒。自PCV3被报道以来，国内外多个地区均检测出该病毒，其危害正逐步受到重视。2017年初，何启盖等在我国首次检出PCV3。目前国内的PCV3毒株主要分为3a、3b和3c三种基因型，其中3a和美国PCV3参考毒株处于相同的进化分支[FuX,FangB,MaJ,etal.Insightsintotheepidemiccharacteristicsandevolutionaryhistoryofthenovelporcinecircovirustype3insouthernChina[J].TransboundaryandEmergingDiseases,2018,65(2):e296-e303.]。Stadejek等对波兰境内14个商品化猪场母猪、仔猪和育成猪的血清进行PCV3检测，证实PCV3感染在欧洲地区同样存在[StadejekT,niakA,ekD,etal.Firstdetectionofporcinecircovirustype3oncommercialpigfarmsinPoland[J].TransboundaryandEmergingDiseases,2017,64(5):1350-1353.]。为控制PCV3的进一步流行，亟需研发针对该病毒的商品化疫苗。PCV3与PCV1、PCV2一样为无囊膜病毒，病毒粒子也呈二十面体结构，具有2kb的单链闭合环状负链DNA基因组，包含三个最主要的开放阅读框。ORF1编码参与病毒基因组复制的相关蛋白，而ORF2编码主导免疫原性的Cap核衣壳结构蛋白，是研制PCV3亚单位基因工程疫苗的理想靶基因[NawagitgulP,MorozovI,BolinSR,etal.Openreadingframe2ofporcinecircovirustype2encodesamajorcapsidprotein[J].JournalofGeneralVirology,2000,81(Pt9):2281-2287.]。PCV3ORF3编码由231个氨基酸组成的功能未知蛋白质。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性较低，仅为30％，此外，二者Cap蛋白的抗原表位也无任何相似性，暗示PCV3和PCV2毒株间的抗原交叉保护性可能很低，现有的PCV2疫苗已无法有效预防PCV3感染[湛洋,王东亮,王乃东,等.猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析[J].畜牧兽医学报,2017,48(6):1076-1084.]。疫苗仍是目前防控PCVD的主要手段，因此，针对新型PCV3感染的疫苗自然会成为全世界研究的热点。不同于原核表达系统、酵母及哺乳动物细胞真核表达系统，杆状病毒表达系统作为真核表达系统之一拥有外源插入基因容量大、蛋白表达水平高、操作简便及翻译后加工修饰等诸多优点而得到广泛应用[LinSY,ChenGY,HuYC.Recentpatentsonthebaculovirussystems[J].RecentPatentsonBiotechnology,2011,5(1):1-11.]。目前，关于PCV2亚单位疫苗的生产主要基于昆虫细胞/杆状病毒表达系统，如英特威公司研制的Circumvent亚单位疫苗[BaechNM,MengXJ.Efficacyandfutureprospectsofcommerciallyavailableandexperimentalvaccinesagainstporcinecircovirustype2(PCV2).VirusRes,2012(164):33-42.]。目前关于PCV3疫苗的报道较少，通过构建重组杆状病毒进行PCV3Cap蛋白的表达，可为开发PCV3亚单位疫苗奠定基础。
技术实现思路
本专利技术通过对PCV3毒株的筛选，设计了扩增PCV3全长的引物；针对PCV3全长Cap基因设计了特异引物，基于Bac-to-Bac系统，获得了表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒。该方法可以方便快捷的构建出表达PCV3Cap蛋白的重组杆状病毒，而且可以确定表达的Cap蛋白具有良好的生物学活性，免疫小鼠发现具有良好的免疫原性。本专利技术得第一个目的是提供表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒，重组杆状病毒rBac-Cap于2018年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心建议的分类命名为：表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒，保藏号为CGMCCNo.15692。本专利技术得第二个目的是提供用于构建重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的引物，其参照GenBank上公布的PCV3序列与Cap基因全长序列独立自主设计，所述引物见表1：表1所需引物及酶切位点引物XhoI-3F的酶切位点为CTCGAG；引物EcoRI-3R的酶切位点为GAATTC；引物Cap-F的酶切位点为GGATCC；引物Cap-R的酶切位点为AAGCTT。本专利技术得第三个目的是提供重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的构建方法，PCV3毒株的筛选；扩增PCV3全长，用以保存PCV3基因组；表达PCV3型Cap基因全长引物的设计，用以扩增PCV3Cap基因全长；转移载体pFastBacTMHTA-Cap的构建；穿梭质粒Bacmid-Cap的获得；重组杆状病毒rBac-Cap的获得；PCV3Cap蛋白的表达鉴定；电镜观察病毒样颗粒；免疫小鼠试验。最终得到可用于工业化生产的表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组杆状病毒rBac-Cap；具体包括以下步骤：1、构建包含PCV3全基因组的pSK-sPCV3：以PCV3DNA为模板，用权利要求1所述的引物XhoI-3F和引物EcoRI-3R扩增出PCV3全基因组；将PCV3全基因组胶回收后与本实验室保存的pBluescriptSK+载体同时用XhoI和EcoRI双酶切，将两种酶切产物纯化回收后按3:1的摩尔比进行连接，最后获得重组质粒pSK-sPCV3；通过XhoI和EcoRI双酶切鉴定重组质粒，酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为2958bp和2000bp的条带；2、转移载体的构建：以pSK-sPCV3重组质粒为模板，用权利要求1所述的引物Cap-F和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，保藏号为CGMCC No.15692。

【技术特征摘要】
1.重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白，保藏号为CGMCCNo.15692。2.用于构建重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的引物，所述引物见表1：表1所需引物及酶切位点引物XhoI-3F的酶切位点为CTCGAG；引物EcoRI-3R的酶切位点为GAATTC；引物Cap-F的酶切位点为GGATCC；引物Cap-R的酶切位点为AAGCTT。3.权利要求1所述的重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的构建方法，其特征是，所述构建方法包括以下步骤：1、构建包含PCV3全基因组的pSK-sPCV3：以PCV3DNA为模板，用权利要求1所述的引物XhoI-3F和引物EcoRI-3R扩增出PCV3全基因组；将PCV3全基因组胶回收后与pBluescriptSK+载体同时用XhoI和EcoRI双酶切，将两种酶切产物纯化回收后进行连接，最后获得重组质粒pSK-sPCV3；2、转移载体的构建：以pSK-sPCV3重组质粒为模板，用权利要求1所述的引物Cap-F和引物Cap-R扩增PCV3Cap全长，将PCR产物纯化后与转移载体pFastBacTMHTA共同进行BamHI和HindIII的双酶切；再次纯化后进行常规连接反应，获得重组质粒pFastBacTMHTA-Cap；提取重组质粒pFastBacTMHTA-Cap，分别利用限制性内切酶BamHI和HindⅢ单酶切鉴定，以及BamHI-HindⅢ的双酶切鉴定；将酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，BamHI和HindⅢ分别单酶切pFastBacTMHTA-Cap质粒，则得到5501bp单一条带；BamHI-HindⅢ双酶切重组质粒pFastBacTMHTA-Cap，则得到4856bp和645bp两个条带；3、穿梭质粒的构建：将BamHI-HindⅢ双酶切鉴定得到4856bp和645bp两个条带的...

【专利技术属性】
技术研发人员：高崧，程清如，高清清，王小波，郇长超，刘秀梵，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32