用于多糖分析的一种同位素标签试剂的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种N‑多糖分析方法，用包含MS/MS可剪切键和能够与N‑多糖缀合的反应性基团的含有季胺的同位素标签试剂标记N‑多糖。同时公开了一种含有同量异位的标签试剂的季胺，其特征在于：其包含下式：报告基团‑平衡基团‑反应基团，具体结构为

Preparation and application of an isotope labeling reagent for polysaccharide analysis

The present invention discloses an analytical method for N polysaccharide. N polysaccharide is labeled with an isotope labeling reagent containing quaternary amine containing MS/MS shearing bonds and reactive groups capable of binding with N polysaccharide. At the same time, a quaternary amine containing the same amount of heterotopic labeling reagent is disclosed, which is characterized by the following formula: report group, equilibrium group and reaction group, and the specific structure is as follows:

【技术实现步骤摘要】
用于多糖分析的一种同位素标签试剂的制备和应用
本专利技术涉及生物分子分析试剂领域，特别是用于生物分子定量分析，具体为用于多糖分析的一种同位素标签试剂的制备和应用。
技术介绍
碳水化合物是在生物生命过程中起重要作用的大分子之一，而各种糖缀合物是其它大分子的最常见修饰之一(Dove，Biotechnol.2001，19,913-917；Dennis，J.W.etal，M.Cell2009,139,1229-1241)。例如，许多蛋白质药物(例如单克隆抗体)有各种多糖修饰，其多糖的组成和化学计量可影响其分子结构的稳定性和功效(Walsh，G.Jefferis，R.，Nat.Biotechnol,2006，24,1241-1252)。因此，多糖的定性和定量测定对于生物医学和生物技术应用都具有重要意义(Marino，K.Nat.Chem.Biol.2010，6，713-723)。然而，由于与其化学性质和结构的复杂性，多糖的研究和其综合分析远远落后于其它生物分子。多糖(别称：碳水化合物或聚糖)是在生物过程如蛋白质运输，细胞与细胞间通信和免疫应答中起关键作用的一类重要的生物分子，并且它们的异常与包括癌症，痴呆和自身免疫病等许多疾病相关，治疗性生物药物如单克隆抗体的效力和稳定性也受它们携带的多糖的影响。由于这些原因，多糖分析(用于质量控制，疾病诊断等)在学术研究，制药工业和保健中具有极大的价值。然而，多糖是缺乏UV吸收并在质谱(MS)中不易电离的亲水性分子。它们的结构是高度异质的，因为每个多糖可以具有多种立体异构体。此外，多糖生物合成是非模板驱动的过程，使得它们的组成和结构难以预测。为了克服这些障碍，多糖分析以往通常被衍生化以改进它们在各种分析平台特别是质谱(MS)中的性能(Ruhaak,L.R.etal.Anal.Bioanal.Chem.2010,397,3457-3481)。用荧光2-氨基苯甲酸(2-AA)和2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记可以使它们与荧光检测兼容，并增强其在MS中的信号(Bigge,J.C.etal.Anal.Biochem.1995,230,229-238)。但是由于峰共洗脱，荧光标记在定量复杂的多糖样品中是十分有限的。多糖上羟基的全甲基化可以改进它们的质谱检测，并且产生用于结构解析的高质量MS2光谱，但是实现精确的定量仍具有挑战性并且样品分析重现性较低(Kang,P.etal.RapidCommun.MassSpectrom.2005,19,3421-3428。近年中与2-AA/2-AB标记(Prien,J.M.etal.Anal.Chem.2010,82,1498-1508)和全甲基化(Alvarez-Manilla,G.etal.Glycobiology2007,17,677-687)获得越来越多的关注以帮助多糖表征和定量(Bowman,M.J.etal..Anal.Chem.2007,79,5777-5784)。存在两种类型的稳定同位素标记方法，质量移位和同量异位标签。质谱移位试剂标签使得来自不同样品的分析物在其前体质量(MS1)上产生几个道尔顿的质量差别，并且通过比较MS1相应质谱峰的强度上实现定量分析。相反，同量异位标签具有相同化学结构和分子量，但在其各种异构分子中各种重核的位置不同。因此，一旦样品被一组同量异位标签标记，它们在MS1中不显示质量差异。在MS/MS碎裂时，产生一系列不同低质量的报告离子用于定量。与质量移位标签相比，目前市售的同量异位标签，如串联质量标签(TMT)10-plex允许同时定量多达10个样品(McAlister,G.C.etal.Anal.Chem.2012,84,7469-7478)，并且不会在MS1光谱中引入更多的复杂性，其通过来自多个样本的信号累加在一起来增加检测灵敏度。因此，其已被广泛用于大规模定量蛋白质(Zhang,J.；Wang,Y.；Li,S.Anal.Chem.2010,82,7588-7595；Zeng,D.；Li,S.Chem.Commun.2009,3369-3371；Chen,Z.etal.Anal.Chem.2012,84.2908-2915)和小分子代谢物(Yuan,W.etal.ProteomeRes.2011,10,5242-5250；Yuan,W.etal.Anal.Chem.2012,84,2892-2899)。已经有实验尝试将同量异位标记用于多糖定量(Yang,S.etal.Anal.Chem.2013,85,8188-8195；Hahne,H.etal.Anal.Chem.2012,84,3716-3724)。然而，由于多糖中的糖苷键在MS/MS碎裂时易于断裂并与报告离子的产生发生竞争，因此最初为多肽分析设计的同量异位标签通常不适合多糖分析。作为补救的方法，被标记的多糖必须与氯化钠(NaCl)进行混合用于MS分析，这主要是因为Na+可以辅助同量异位标签的片段化以产生更多的报告物离子。这种方法所引起的问题是盐离子可以严重抑制电喷雾离子源(ESI)的离子化，降低ESI-MS中的多糖的信号。多糖也可以形成多个H+/Na+加合物，将分子复杂化，进一步降低它们的检测灵敏度。因此，多糖分析领域仍然需要新技术，特别是用于增强多糖定量分析的试剂和方法。
技术实现思路
多糖作为在多个重要生物过程如蛋白质运输，细胞与细胞间通信和免疫应答中起关键作用的生物分子，它们的结构与表达量与许多复杂性疾病(例如癌症，痴呆和自身免疫病等)密切相关。同时，大多数蛋白药物(例如单克隆抗体)也携带多糖，且其在人体内的稳定性及疗效受到这些多糖的影响。因此，多糖分析有着广泛的应用。例如，本专利技术所提供的方法可应用于下列各种场景(但不仅限于这些场景)：(1)在蛋白药物的研发与生产过程中，用于分析多糖来提高蛋白药物的疗效以及质量控制；(2)对一大类先天性糖基化病(congenitaldisorderofglycosylation)进行诊断；(3)在开发多糖疫苗(包括艾滋病等多种病毒传染病)过程中，用于研究疫苗的有效性。针对这些应用，本专利技术公开了N-多糖分析方法、含有季胺的同位素标签试剂及其制备方法。本专利技术提供如下技术方案：本专利技术涉及用于生物分子分析的含有季胺的同位素标签试剂的应用，以及制备和使用季胺同位素标签试剂的方法。季胺同位素标签试剂在多糖分子分析具有独特的应用，尤其是通过串联质谱法的多糖定量。本专利技术提供了一种N-多糖分析方法，用包含MS/MS可剪切键和能够与N-多糖缀合的反应性基团的含有季胺的同位素标签试剂标记N-多糖。作为本专利技术的进一步的技术方案，所述含有季胺的同位素标签试剂包括下式：报告组-平衡组-反应组，其中报告基团和平衡基团通过MS/MS可剪切键连接。作为本专利技术的进一步的技术方案，所述含有季胺的同位素标签试剂包括下式结构：报告基团-平衡基团-反应基团，具体结构为其中位置1-3中的至少一个包含同位素原子，报告基团和平衡基团通过MS/MS可剪切键连接，并且R是能够与多糖缀合的反应基团。作为本专利技术的进一步的技术方案，所述报告基团的质量在176至179Da的范围内，并且所述试剂含有独立地选自13C和2H的2或3个同位素原子。作为本专利技术的进一步的技术方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种N‑多糖分析方法，其特征在于：用包含MS/MS可剪切键和能够与N‑多糖缀合的反应性基团的含有季胺的同位素标签试剂标记N‑多糖。

【技术特征摘要】
1.一种N-多糖分析方法，其特征在于：用包含MS/MS可剪切键和能够与N-多糖缀合的反应性基团的含有季胺的同位素标签试剂标记N-多糖。2.如权利要求1所述的N-多糖分析方法，其特征在于：所述含有季胺的同位素标签试剂包括下式：报告组-平衡组-反应组，其中报告基团和平衡基团通过MS/MS可剪切键连接。3.如权利要求2所述的N-多糖分析方法，其特征在于：所述含有季胺的同位素标签试剂包括下式结构：报告基团-平衡基团-反应基团，具体结构为其中位置1-3中的至少一个包含同位素原子，报告基团和平衡基团通过MS/MS可剪切键连接，并且R是能够与多糖缀合的反应基团。4.如权利要求3所述的N-多糖分析方法，其特征在于：所述报告基团的质量在176至179Da的范围内，并且所述试剂含有独立地选自13C和2H的2或3个同位素原子。5.如权利要求1所述的N-多糖分析方法，其特征在于：所述N-多糖通过以下方法获得：(1)在固体支持物上固定包含N-多糖的糖蛋白；(2)化学修饰所述N-多糖；(3)从固体支持物释放N-多糖；其中所述糖蛋白获自人或非人动物血清；所述N-多糖携带唾液酸，所述N-多糖的化学修饰包括唾液酸的碳二亚胺偶联；对N-多糖定量分析，所述定量分析步骤包括片段化、定量两步，标记后的N-多糖在MS/MS中产生特征碎片峰，根据特征峰的强度对N-多糖进行定量；其中Na+不用于定量分析标记的N-多糖。6.一种含有季胺的同位素标签试剂，其特征在于：含有季胺的同位素标签试剂包括下式：报告基团-平衡基团-反应基团，具体结构为其中位置1-3中的至少一个包含同位素原子，报告基团和平衡基团通过MS/MS可断裂键连接，并且R是能够与多糖缀合的反应基团。7.如权利要求11所述的含有季胺的同位素标签试剂，其特征在于：含有季胺的同位...

【专利技术属性】
技术研发人员：李舒伟，王美瑶，杨霜，
申请(专利权)人：南京谱利健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32