血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质及其制备方法技术

一种血清型冻干粉25‑羟基维生素D3和D2质量控制物质及其制备方法，该冻干粉溶液状态时各组分加入溶液后在混合物中的各自含量为：25‑羟基维生素D3 10～200ng/mL，25‑羟基维生素D2 0～200ng/mL，冻干保护剂0.5％～15％，填充剂为0.5％～15％，抗氧化剂0.1～30mmol/L，酸碱调节剂0.1～100mmol/L，防腐剂0.01％～5％。该物质具有均匀性、稳定性好，不需要低温冷冻保存，而且其可用于25‑羟基维生素D3、D2的校准品，也可用于25‑羟基维生素D3、D2的质控品等的优点。

Quality control substances of 25-hydroxyvitamin D3 and D2 in serotype freeze-dried powder and their preparation methods

A quality control substance of serum-type freeze-dried powder 25 hydroxyvitamin D3 and D2 and its preparation method. The content of each component in the mixture after adding solution in the freeze-dried powder solution state is 25 hydroxyvitamin D3 10-200 ng/mL, 25 hydroxyvitamin D2 0-200 ng/mL, freeze-dried protectant 0.5%-15%, filler 0.5%-15%, antioxidant 0.1-30 mmol/L, acid. The alkali regulator is 0.1-100 mmol/L and the preservative is 0.01%-5%. The substance has the advantages of uniformity, good stability, no need of cryopreservation, and can be used for calibration of 25 -hydroxyvitamin D3 and D2, as well as for quality control of 25 -hydroxyvitamin D3 and D2.

【技术实现步骤摘要】
血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质及其制备方法
本专利技术涉及25-羟基维生素D3和D2质量控制物质
，具体的涉及一种均匀性好、稳定性好，不需要冷冻保存的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质及其制备方法。研究背景维生素D(VitaminD)是一种脂溶性维生素，为固醇类衍生物，主要生理功能是调节人体内钙、磷代谢，对促进钙的吸收、维持人体内钙浓度水平、促进和维持骨骼的正常生长和发育起重要作用。儿童缺乏维生素D会导致骨骼畸形，如出现佝偻病等；而成人缺乏维生素D会导致骨质疏松症。最近有研究证实，血清中较高浓度水平的维生素D可降低乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的发病率；较低浓度水平的维生素D也可能是一个潜在的心血管疾病危险因素。维生素D具有几个不同于其他维生素的特点：①它是一种类固醇，其作用类似于其它类固醇激素；②当皮肤等得到足够的阳光紫外线照射后，身体就可贮存一定量的维生素D；③仅有的可转换成激素型的维生素。目前已知的维生素D至少有10种，其中最重要的是D2和D3两种，维生素D2又称麦角钙化醇、维生素D3又称胆钙化醇，二者不能相互转化。对绝大多数人来说，阳光照射形成维生素D是维生素D3的主要来源，而维生素D2主要存在于各种食物中。这两种维生素D经血液循环进入肝脏后经25-羟化酶催化转化为较稳定的25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，总称25-羟基维生素D，然后在肝脏中进一步代谢形成具有生物学活性的1,25-双羟维生素D。人体内血液循环中的25-羟基维生素D和1,25-双羟维生素D大约有85％～88％与维生素D结合蛋白(vitaminDbindingprotein，DBP)结合，12％～15％与白蛋白结合，大约不到1％为游离形式。由于维生素D和1,25-双羟维生素D的半衰期相对较短(<2d)，因此，半衰期长、性质稳定的25-羟基维生素D被认为是评价体内维生素D水平的重要指标。人血液中25-羟基维生素D≤20ng/mL为缺乏，25-羟基维生素D在21～29ng/mL为相对不足，25-羟基维生素D≥30ng/mL为维生素D充足。按照此标准，国内有78％～98％的普通人群出现维生素D缺乏，其中有约30％严重不足。有研究者对5531例北京城区居民的维生素D含量水平进行研究，显示缺乏患病率高达87.1％，平均25-羟基维生素D水平仅为(12.3±7.5)ng/mL，远低于美国人(23～25)ng/mL和加拿大人的(25～31)ng/mL水平。随着老年人年龄的增加维生素D水平不断降低，婴幼儿、儿童和适孕妇女中，人群维生素D水平亦不高，缺乏或不足所占比例达30％～98％。因此应该重视中国人群的维生素D状况。目前市场上25-羟基维生素D试剂盒检测方法主要有酶联免疫法、荧光免疫层析法、胶体金免疫层析法、化学发光法、酶供体竞争法、克隆酶工体竞争法和液相色谱-串联质谱法等。维生素D的准确测定需要一个稳定质量控制物质来校准、监控仪器状态和试剂的好坏，虽然各种试剂盒均有配套的维生素D质控品，有冻干、液体等不同类型，而关于25-羟基维生素D3、D2质量控制物质的专利目前国内尚无相关的报道信息。在临床检测维生素D中，由于检测样本为人血清，如果质量控制物质的基质与人血清相同或相似，就可以更好的监测实验方法的准确性和稳定性。虽然直接使用人血清作为质量控制物质用于维生素D的临床监测，但由于人血清为液体，临床实验室大多也缺少超低温保存装置，导致其不宜长久保存。目前市场上已有的25-羟基维生素D质控品，有些基质不是人血清，经加速(37.0℃)稳定性考察后稳定性也欠佳。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述不足，提供一种血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质，该物质具有均匀性、稳定性好，不需要低温冷冻保存，而且其可用于25-羟基维生素D3、D2的校准品，也可用于25-羟基维生素D3、D2的质控品等。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质，该冻干粉质量控制物质为：以血清为基质按要求浓度加入25-羟基维生素D3、D2后再加入赋形剂、防腐剂等，搅拌均匀后，进行低温预冻、冷冻干燥，制备成25-羟基维生素D3、D2质量控制物质的冻干粉；所述的赋形剂包括但不限于冻干保护剂、填充剂、抗氧化剂、酸碱调节剂，各组分加入溶液后在混合物中的各自含量为：25-羟基维生素D310～200ng/mL，25-羟基维生素D20～200ng/mL，冻干保护剂0.5％～15％，填充剂为0.5％～15％，抗氧化剂0.1～30mmol/L，酸碱调节剂0.1～100mmol/L，防腐剂0.01％～5％。本专利技术还提供一种上述血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，步骤包括：(1)搜集无病毒的血清或从正常人体搜集来的、用柠檬酸盐和磷酸盐保护的混合血清在-20℃保存，并避免反复冻融；临用前先放2～8℃使其初步融化，然后室温下使之全部融化，完全解冻后混匀，依次用滤纸、0.45μm、0.22μm微孔滤膜进行过滤除去其中的杂质；(2)在血清中添加沉淀剂或者沉淀剂与二价离子的混合物质进行沉淀、离心等澄清处理获得基质血清；(3)取步骤(2)中基质血清加入25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的标准溶液制成特定浓度要求的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质；(4)取步骤(3)中制备的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质，加入赋形剂、防腐剂等，搅拌均匀后进行低温预冻、冷冻干燥，制备成冻干粉(如需要使用将冻干粉复溶后即可使用)。本专利技术上述步骤(1)无病毒如无黄疸、丙肝、乙肝、乳糜、梅毒、HIV等的血清(此步中，各血清样本需经过必要的对应的传染病筛查，结果为阴性时才能使用)；如血清长时间放置在2～8℃，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻黏连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的浑浊；因此此步骤推荐血清放-20℃保存，并避免反复冻融；临用前先放2～8℃使其初步融化，然后室温下使之全部融化，完全解冻后，上下轻轻颠倒混匀，并将所有血清混合在一起，搅拌均匀，依次用滤纸、0.45μm、0.22μm微孔滤膜进行过滤除去其中的杂质。本专利技术上述步骤(1)从正常人体搜集来的、用柠檬酸盐和磷酸盐保护的混合血清，使用前需将血清用5g/L～9g/L的NaCl溶液进行透析，以除去多余的小分子酸性化合物和金属离子螯合剂，同时也可以使血清pH值恢复到正常水平、使用一些碱性溶液，如NaOH溶液(1～6mol/L)将血清pH调至7.4～8.0。本专利技术上述步骤(2)因血清中存在很多不同的组分，有些成分特别是脂蛋白在经过反复冻融或冻干、再复溶时会出现结构上的变化，导致样本浑浊，澄清度不佳；该步骤采用添加沉淀剂进行化学沉淀处理，常用的沉淀剂为聚阴离子/多阴离子(如磷钨酸(PTA)、硫酸葡聚糖(DS)、盐酸葡聚糖、肝素)或非离子多聚体(如聚乙二醇(PEG)；或者是上述的沉淀剂即聚阴离子/多阴离子、非离子多聚体等中的一种与某些二价阳离子(Mg2+、Ca2+、Mn2+)联合使用。本专利技术上述步骤(2)所使用的沉淀剂用量，其中磷钨酸(PTA)、硫酸葡聚糖、盐酸葡聚糖、肝素或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血清型冻干粉25‑羟基维生素D3和D2质量控制物质，其特征在于：该冻干粉质量控制物质为：以血清为基质按要求浓度加入25‑羟基维生素D3、D2后再加入赋形剂、防腐剂，搅拌均匀后，进行低温预冻、冷冻干燥，制备成25‑羟基维生素D3、D2质量控制物质的冻干粉：所述的赋形剂包括但不限于冻干保护剂、填充剂、抗氧化剂、酸碱调节剂，各组分加入溶液后在混合物中的各自含量为：25‑羟基维生素D3 10～200ng/mL，25‑羟基维生素D2 0～200ng/mL，冻干保护剂0.5％～15％，填充剂为0.5％～15％，抗氧化剂0.1～30mmol/L，酸碱调节剂0.1～100mmol/L，防腐剂0.01％～5％。

【技术特征摘要】
1.一种血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质，其特征在于：该冻干粉质量控制物质为：以血清为基质按要求浓度加入25-羟基维生素D3、D2后再加入赋形剂、防腐剂，搅拌均匀后，进行低温预冻、冷冻干燥，制备成25-羟基维生素D3、D2质量控制物质的冻干粉：所述的赋形剂包括但不限于冻干保护剂、填充剂、抗氧化剂、酸碱调节剂，各组分加入溶液后在混合物中的各自含量为：25-羟基维生素D310～200ng/mL，25-羟基维生素D20～200ng/mL，冻干保护剂0.5％～15％，填充剂为0.5％～15％，抗氧化剂0.1～30mmol/L，酸碱调节剂0.1～100mmol/L，防腐剂0.01％～5％。2.根据权利要求1所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤包括：(1)搜集无病毒血清或从正常人体搜集来的、用柠檬酸盐和磷酸盐保护的混合血清在-20℃保存，并避免反复冻融；临用前先放2～8℃使其初步融化，然后室温下使之全部融化，完全解冻后混匀，依次用滤纸、0.45μm、0.22μm微孔滤膜进行过滤除去其中的杂质；(2)在血清中添加沉淀剂或者沉淀剂与二价离子的混合物质进行沉淀、离心澄清处理获得基质血清；(3)取步骤(2)中基质血清加入25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2的标准溶液制成特定浓度要求的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质；(4)取步骤(3)中制备的血清基质25-羟基维生素D3、D2质量控制物质，加入赋形剂、防腐剂等，搅拌均匀后进行低温预冻、冷冻干燥，制备成冻干粉。3.根据权利要求2所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(1)从正常人体搜集来的、用柠檬酸盐和磷酸盐保护的混合血清，使用前需将血清用5g/L～9g/L的NaCl溶液进行透析，和/或为了使血清pH值恢复到正常水平、使用碱性溶液将血清pH调至7.4～8.0。4.根据权利要求2所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(2)添加沉淀剂或者沉淀剂与二价离子的混合物质后，则放置30min～72h，然后温度在10～20℃经离心至少10min，将血清中产生的沉淀聚集在离心管底部，取上部澄清血清备用。5.根据权利要求2所述的血清型冻干粉25-羟基维生素D3和D2质量控制物质的制备方法，其特征在于：步骤(2)所使用的沉淀剂为磷钨酸、硫酸葡聚糖、盐酸葡聚糖、肝素或PEG中的一种，其浓度为0～10g/L；所述的二价阳离子为Mg2+、Ca2+或Mn2+，其浓度在0～100mmol/L。6.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹继华，沈敏，古咏梅，杨晓东，潘清清，王琳，李全乐，邹炳德，
申请(专利权)人：美康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33