一种植物多基因表达载体、转化子及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种植物多基因表达载体、含有该载体的转化体及其应用。该载体含有抗虫基因CAL以及抗草甘膦基因G10。本发明专利技术的植物多基因表达载体转化大肠杆菌可得到含有该质粒的大肠杆菌转化子；转化农杆菌可得到含有该质粒的农杆菌转化子。该农杆菌转化子可用于转化植物，获得抗虫抗除草剂的转基因植物。

【技术实现步骤摘要】
一种植物多基因表达载体、转化子及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效植物多基因表达载体、含有该载体的转化体及其应用。技术背景大豆是重要的粮食经济作物。杂草的侵害和害虫的危害是影响大豆产量的重要因素。虽然使用杀虫剂防治害虫能在短期内起到一定的效果，但这种方法并不环保并且效率有限。通过转基因的方法可以使植物获得外源基因，从而使植物获得所需的性状，如导入抗除草剂草甘膦的EPSPS基因可以大大简化田间杂草管理，降低成本；导入来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的杀虫蛋白基因，可以使作物获得对一些靶标害虫的抗性，从而减少虫害造成的损失。导入外源基因可能会对作物的农艺性状造成一些影响，因此需要优化载体的结构，如选择合适的启动子和终止子等元件，调节基因在时空上的适量表达，从而在获得需要的性状的同时又减少对作物农艺性状的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是为培育抗虫抗草甘膦的作物提供一种新型高效植物多基因表达载体和含有该载体的转化子及其应用。用携带该载体的工程菌转化植物，并通过筛选可获得抗草甘膦抗虫的转基因植物。本专利技术采用的技术方案：本专利技术提供一种植物多基因表达载体，所述表达载体是在基本载体pCAMBIA1300的XhoI位点插入抗草甘膦基因G10表达框，同时在MCS位点插入抗虫基因CAL表达框而构成。进一步，所述抗草甘膦基因G10核苷酸序列为SEQIDNO:1所示(氨基酸序列为SEQIDNO:2所示)，所述抗虫基因CAL核苷酸序列为SEQIDNO:3所示(氨基酸序列为SEQIDNO:4所示)。进一步，抗草甘膦基因G10表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQIDNO:5所示转录调控区的启动子CaMV35spromoter，SEQIDNO:6所示TEV5’UTR以及SEQIDNO:7所示转导肽序列CTP，SEQIDNO:1所示抗草甘膦基因G10和SEQIDNO:8所示3’端的CaMV35s终止子片段。进一步，抗虫基因CAL表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQIDNO:9所示转录调控区的启动子CSV，SEQIDNO:3所示抗虫基因CAL和SEQIDNO:10所示3’端的NOS终止子。本专利技术还提供一种含有所述植物多基因表达载体的转化子。本专利技术还提供一种所述植物多基因表达载体在制备转基因植物细胞中的应用，所述植物细胞中植物为大豆、玉米或油菜。本专利技术的植物多基因表达载体可以是在基本载体pCAMBIA1300(NCBIaccession:AF234296.1)的XhoI位点插入草甘膦抗性基因G10表达框，同时在MCS位点插入抗虫基因CAL表达框构成。所用的基本载体pCAMBIA1300中含有Ti质粒中T-DNA的左右边界序列(LB和RB)，在该片段中含有两端为XhoI酶切位点的hygromycine抗性基因表达框，在该处用根据双子叶植物密码子偏好人工合成的草甘膦抗性基因G10(SEQIDNO：1)的表达框替换hygromycine抗性基因表达框，同时，该基本载体含有多克隆位点(MCS)，在MCS位点处插入抗虫基因CAL表达框。所得到的植物多基因表达载体之一命名为p1300-CSV/CAL-35s/G10，其所携带的抗草甘膦基因为G10，抗虫基因为CAL，这些基因位于载体的T-DNA左右边界序列LB和RB区域之中。由本专利技术的植物多表达载体转化大肠杆菌得到含有该质粒载体的大肠杆菌转化子。由本专利技术的植物多基因表达载体转化农杆菌LBA4404可得到含有该质粒的农杆菌转化子。该农杆菌转化子可用于转化植物，获得同时抗草甘膦和抗棉铃虫、黏虫、斜纹夜蛾、豆荚螟等多种害虫的大豆。本专利技术的植物多基因表达载体转化农杆菌得到的含有该质粒载体的农杆菌转化子用于转化大豆，并以草甘膦为筛选标记进行筛选，可获得同时抗草甘膦，抗棉铃虫、黏虫、斜纹夜蛾、豆荚螟等多种害虫的大豆。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：利用本专利技术提供的优化设计的植物转化载体得到的转基因植物具有良好的草甘膦抗性，同时具有良好棉铃虫、黏虫、斜纹夜蛾、豆荚螟抗性。附图说明图1是含有G10基因和CAL的p1300-CSV/CAL-35S/G10植物多价基因表达质粒示意图。具体实施方式以下通过附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1植物多价表达载体的构建按照表1所示的酶切反应及电泳体系将pCAMBIA1300质粒用XhoI酶切去除hygromycine抗性基因，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段1300-35s，FastAP进行去磷酸化。同时按照表1所示的酶切反应及电泳体系将人工合成的含有G10的TEV5’UTR-CTP-G10(SEQIDNO:11)克隆至pUC57的质粒用XhoI酶切后回收。然后用T4连接酶将片段TEV5’UTR-CTP-G10和载体1300-35s进行连接(连接反应体系见表2)，得到含有G10表达框的p1300-35s/G10质粒。按照表1所示的双酶切反应及电泳条件将人工合成的CAL-NOSter(SEQIDNO:12)从pUC57载体中用BamHI、KpnI切下，琼脂糖凝胶电泳回收片段CAL；按照表1所示的双酶切反应及电泳条件将人工合成的CSV启动子(SEQIDNO:9)从pUC57载体中用HindIII、BamHI切下，琼脂糖凝胶电泳回收片段CSV启动子；按照表1所示的双酶切反应及电泳条件将p1300-35s/G10质粒用HindIII、KpnI酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段p1300-35s/G10，然后用T4连接酶将片段CAL-NOSter、CSV启动子、载体片段p1300-35s/G10进行连接(连接反应体系见表3)，得到载体p1300-CSV/CAL-35s/G10(图1)。表1酶切反应及电泳体系在37℃恒温箱中保温1-1.5小时，然后用1×TAE(0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTA)电泳缓冲液配置1.0％的琼脂糖凝胶电泳，在琼脂糖凝胶电泳里加入EB(溴化乙锭)至终浓度为0.5μg/ml，在3-5V/cm的电压下电泳。表2两片段连接反应体系在16℃条件下连接过夜。表3三片段连接反应体系在16℃条件下连接过夜。实施例2大肠杆菌转化子的获得大肠杆菌转化：①取实施例1中的连接产物(多价质粒载体p1300-CSV/CAL-35s/G10)10ul加入大肠杆菌TG1感受态细胞中，轻轻混匀，再于冰上静置约30min；②42℃热击90s，然后迅速置于冰上冷却2min；③加入1ml无抗生素的灭菌的LB液体培养基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，1L蒸馏水，高温高压灭菌)，放入37℃培养箱中培养约1h；④4000rpm离心3min，弃上清，用枪头混匀离心管底残留LB培养液与大肠杆菌；⑤将菌液均匀涂布在含50ug/L卡那霉素的LB固体培养基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，15g琼脂，1L蒸馏水，高温高压灭菌)上，先正面向上放置于37℃培养箱中1h至菌液完全吸收，再倒置培养约8-10h至出现白色菌落。挑取单菌落，摇菌过夜，采用AxygeneMiniprep质粒小量制备试剂盒抽提质粒，经PCR和酶切检测后，挑选出阳性质粒，保存相应的菌落，即转化子。该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物多基因表达载体，其特征在于所述表达载体是在基本载体pCAMBIA1300的XhoI位点插入抗草甘膦基因G10表达框，同时在MCS位点插入抗虫基因CAL表达框而构成。

【技术特征摘要】
1.一种植物多基因表达载体，其特征在于所述表达载体是在基本载体pCAMBIA1300的XhoI位点插入抗草甘膦基因G10表达框，同时在MCS位点插入抗虫基因CAL表达框而构成。2.如权利要求1所述植物多基因表达载体，其特征在于所述抗草甘膦基因G10核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，所述抗虫基因CAL核苷酸序列为SEQIDNO:3所示。3.如权利要求1所述植物多基因表达载体，其特征在于抗草甘膦基因G10表达框的构成是：从5’到3’端方向依次为SEQIDNO:5所示转录调控区的启动子CaMV35s，SEQIDNO:6所示TEV5’UTR，SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑挺，沈志成，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33