一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法。本发明专利技术公开的西瓜遗传转化方法，包括：1)采用含有重组农杆菌的侵染液侵染西瓜外植体，将侵染后的西瓜外植体于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；重组农杆菌含有载有目的基因和BASTA基因的重组表达载体；2)将共培养后的外植体于筛选培养基上培养，得到含有阳性芽的植物组织；3)将阳性芽的植物组织于芽伸长培养基上培养，得到具有西瓜地上部分的幼苗；4)将具有西瓜地上部分的幼苗于生根培养基上培养，得到西瓜植株；5)从西瓜植株中筛选含有目的基因的植株，得到完成遗传转化的西瓜植株。利用本发明专利技术的方法可以实现对西瓜高转化频率、高重复性的转化。

A High Efficient Method for Genetic Transformation and Identification of Transgenic Plants in Watermelon

The invention discloses a method for efficient genetic transformation and identification of transgenic plants of watermelon. The watermelon genetic transformation method disclosed in the present invention includes: 1) using the infection solution containing recombinant Agrobacterium tumefaciens to infect watermelon explants, co-culturing the infected watermelon explants on the co-culture medium to obtain the co-culture explants; the recombinant Agrobacterium tumefaciens containing the recombinant expression vector containing the target gene and BASTA gene; 2) culturing the co-cultured explants on the screening medium; The plants with positive buds were cultured on the shoot elongation medium to obtain seedlings with above-ground parts of watermelon; 4) seedlings with above-ground parts of watermelon were cultured on rooting medium to obtain watermelon plants; 5) plants with target genes were screened from watermelon plants to obtain watermelon plants with genetic transformation. The method of the invention can realize the transformation of watermelon with high conversion frequency and high repeatability.

【技术实现步骤摘要】
一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法
本专利技术涉及植物遗传学和基因工程领域中，一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法。
技术介绍
西瓜(Citrulluslanatus(Thunb.)Mansfeld.etNakai)为葫芦科(Cucurbitaceae)西瓜属一年生草本蔓生植物，是一种重要的园艺作物。西瓜遗传基础狭窄，种质资源缺乏，很多重要的性状无法通过常规育种方法进行改良。基因工程技术就成为对常规育种的有效补充手段。随着生物技术的不断发展，利用转基因技术及基因编辑技术对遗传物质进行人为操作开始广泛应用于各种植物中，为创制新种质提供了新方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何进行西瓜的遗传转化。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了农杆菌介导的西瓜遗传转化方法，所述方法包括：1)采用含有重组农杆菌的侵染液侵染西瓜外植体，将侵染后的西瓜外植体于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述重组农杆菌含有载有目的基因和BASTA基因的重组表达载体；2)将所述共培养后的外植体于筛选培养基上培养，得到含有阳性芽的植物组织；3)将所述阳性芽的植物组织于芽伸长培养基上培养，得到具有西瓜地上部分的幼苗；4)将所述具有西瓜地上部分的幼苗于生根培养基上培养，得到西瓜植株；5)从所述西瓜植株中筛选含有所述目的基因的植株，得到完成遗传转化的西瓜植株。上述方法中，步骤5)可包括51)或52)：51)利用BASTA试纸条筛选所述西瓜植株，产生目标阳性线的植株即为所述完成遗传转化的西瓜植株，无目标阳性线的植株不为完成遗传转化的西瓜植株；52)向步骤4)得到的西瓜植株或其任意部位涂抹草铵膦，不发生枯死的植株或涂抹草铵膦部位不发生枯死的植株即为所述完成遗传转化的西瓜植株，发生枯死的植株或涂抹草铵膦部位不发生枯死的植株不为完成遗传转化的西瓜植株。上述方法中，所述西瓜外植体可为a1)或a2)或a3)：a1)西瓜子叶；a2)西瓜未展子叶；a3)西瓜未展子叶中段。所述西瓜未展子叶中段具体可为子叶叶尖和叶柄基部间的组织。所述外植体的大小可根据需要调整。在本专利技术的一个实施例中，所述外植体的大小为1.5mm×1.5mm。上述方法中，所述共培养培养基可含有6-BA，6-BA在所述共培养培养基中的浓度可为1-2mg/L。所述筛选培养基可含有6-BA、特美汀(Timentin)和草铵膦(basta)，6-BA、特美汀和草铵膦在所述筛选培养基中的浓度分别可为1-2mg/L、100-300mg/L和1-3mg/L。所述芽伸长培养基可含有6-BA、NAA、特美汀和草铵膦，6-BA、NAA、特美汀和草铵膦在所述芽伸长培养基中的浓度分别可为0.05-0.2mg/L、0.01-0.02mg/L、100-300mg/L和1-3mg/L。所述生根培养基可含有IBA和特美汀，IBA和特美汀在所述生根培养基中的浓度分别可为1-2mg/L和100-200mg/L。上述方法中，所述共培养培养基可含有6-BA，6-BA在所述共培养培养基中的浓度为1.5mg/L。所述筛选培养基可含有6-BA、特美汀和草铵膦，6-BA、特美汀和草铵膦在所述筛选培养基中的浓度分别可为1.5mg/L、100mg/L和2mg/L。所述芽伸长培养基可含有6-BA、NAA、特美汀和草铵膦。所述芽伸长培养基中6-BA与NAA的浓度比大于等于5小于等于20。6-BA、NAA、特美汀和草铵膦在所述芽伸长培养基中的浓度分别可为0.1mg/L、0.01mg/L、100mg/L和2mg/L。所述生根培养基可含有IBA和特美汀，IBA和特美汀在所述生根培养基中的浓度分别可为1mg/L和100mg/L。上述方法中，所述共培养培养基可为由MS培养基和6-BA组成的固体培养基。所述筛选培养基可为由MS培养基与6-BA、特美汀和草铵膦组成的固体培养基。所述芽伸长培养基可为由MS培养基与6-BA、NAA、特美汀和草铵膦组成的固体培养基。所述生根培养基可为由MS培养基与IBA和特美汀组成的固体培养基。所述共培养培养基的pH可为5.7-5.9。所述共培养培养基的pH具体可为5.8。所述筛选培养基的pH可为5.7-5.9。所述筛选培养基的pH具体可为5.8。所述芽伸长培养基的pH可为5.7-5.9。所述芽伸长培养基的pH具体可为5.8。所述生根培养基的pH可为为5.7-5.9。所述生根培养基的pH具体可为5.8。上述方法中，步骤1)中共培养可在无光环境中进行，共培养的时间可为a1)或a2)：a1)2.5-3.5天；a2)3天。所述农杆菌可为农杆菌菌株EHAl05。所述重组表达载体可为向具有bar抗性的植物双元载体导入所述目的基因得到的重组载体。所述具有bar抗性的植物双元载体具体可为植物双元载体pYBA1302。所述重组表达载体能用于所述目的基因和所述BASTA基因的遗传转化。所述重组表达载体能表达BASTA蛋白质。所述BASTA蛋白质可为序列表中序列1所示的蛋白质。所述重组表达载体含有BASTA基因。所述BASTA基因可为序列表中序列2所示的DNA片段。所述含有重组农杆菌的侵染液可为利用侵染液悬浮所述重组农杆菌得到的菌体悬液。所述侵染液可为无菌MS液体培养基。所述含有重组农杆菌的侵染液的OD600为0.02-0.1，如0.05。步骤1)中所述侵染的时间可为10分钟。将所述共培养后的外植体于筛选培养基上培养时，可根据情况更换新的筛选培养基。所述共培养培养基、所述筛选培养基、所述芽伸长培养基和所述生根培养基均可为无菌培养基。所述西瓜可为栽培西瓜或野生西瓜。在本专利技术的一个实施例中，所述栽培西瓜为栽培西瓜品种97103，所述野生西瓜为野生西瓜品种PI296341。本专利技术还提供了下述X1)或X2)的试剂：X1)培养基，为所述共培养培养基、所述筛选培养基、所述芽伸长培养基或所述生根培养基；X2)成套培养基，由所述共培养培养基、所述筛选培养基、所述芽伸长培养基和所述生根培养基组成。所述成套培养基可用于西瓜的遗传转化。本专利技术还提供了下述任一应用：Y1)所述农杆菌介导的西瓜遗传转化方法在西瓜育种中的应用；Y2)所述试剂在西瓜遗传转化中的应用；Y3)所述试剂在制备西瓜遗传转化产品中的应用；Y4)所述试剂在西瓜育种中的应用。本专利技术建立了一种西瓜遗传转化方法，利用该方法可以实现对西瓜高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化；另一方面，通过本专利技术只需要进行BARST试纸条检测，可以方便、快捷、准确的鉴定出阳性植株，后期田间鉴定涂抹法省时省工，为大规模的开展西瓜分子育种工作提供了可能。附图说明图1是侵染后的外植体在共培养培养基中的生长情况。图2是共培养后的外植体在筛选培养基中的生长情况。图3是含有芽的植物组织或其芽在芽伸长培养基中的生长情况。图4是幼芽在生根培养基中的生长情况。图5是利用BASTA试纸条测定幼苗是否为阳性转基因的情况。阳性表示阳性转基因植株，非阳性表示阴性转基因植株。图6是移栽到温室中的阳性西瓜转基因植株。图7为田间遗传转化后的植株经过草铵膦涂抹2天后的反应情况。左图为阳性转基因植株，右图为阴性转基因植株。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.农杆菌介导的西瓜遗传转化方法，包括：1)采用含有重组农杆菌的侵染液侵染西瓜外植体，将侵染后的西瓜外植体于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述重组农杆菌含有载有目的基因和BASTA基因的重组表达载体；2)将所述共培养后的外植体于筛选培养基上培养，得到含有阳性芽的植物组织；3)将所述阳性芽的植物组织于芽伸长培养基上培养，得到具有西瓜地上部分的幼苗；4)将所述具有西瓜地上部分的幼苗于生根培养基上培养，得到西瓜植株；5)从所述西瓜植株中筛选含有所述目的基因的植株，得到完成遗传转化的西瓜植株。

【技术特征摘要】
1.农杆菌介导的西瓜遗传转化方法，包括：1)采用含有重组农杆菌的侵染液侵染西瓜外植体，将侵染后的西瓜外植体于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述重组农杆菌含有载有目的基因和BASTA基因的重组表达载体；2)将所述共培养后的外植体于筛选培养基上培养，得到含有阳性芽的植物组织；3)将所述阳性芽的植物组织于芽伸长培养基上培养，得到具有西瓜地上部分的幼苗；4)将所述具有西瓜地上部分的幼苗于生根培养基上培养，得到西瓜植株；5)从所述西瓜植株中筛选含有所述目的基因的植株，得到完成遗传转化的西瓜植株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)包括51)或52)：51)利用BASTA试纸条筛选所述西瓜植株，产生目标阳性线的植株即为所述完成遗传转化的西瓜植株，无目标阳性线的植株不为完成遗传转化的西瓜植株；52)向步骤4)得到的西瓜植株或其任意部位涂抹草铵膦，不发生枯死的植株或涂抹草铵膦部位不发生枯死的植株即为所述完成遗传转化的西瓜植株，发生枯死的植株或涂抹草铵膦部位不发生枯死的植株不为完成遗传转化的西瓜植株。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述西瓜外植体为a1)或a2)或a3)：a1)西瓜子叶；a2)西瓜未展子叶；a3)西瓜未展子叶中段。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述共培养培养基含有6-BA，6-BA在所述共培养培养基中的浓度为1-2mg/L；和/或，所述筛选培养基含有6-BA、特美汀和草铵膦，6-BA、特美汀和草铵膦在所述筛选培养基中的浓度分别为1-2mg/L、100-300mg/L和1-3mg/L；和/或，所述芽伸长培养基含有6-BA、NAA、特美汀和草铵膦，6-BA、NAA、特美汀和草铵膦在所述芽伸长培养基中的浓度分别为0.05-0.2mg/L、0.01-0.02mg/L、100-300mg/L和1-3mg/L；和/或，所述生根培养基含有IBA和特美汀，IBA和特美汀在所述生根培养基中的浓度分...

【专利技术属性】
技术研发人员：许勇，张洁，田守蔚，宗梅，张海英，宫国义，刘凡，郭绍贵，任毅，李茂营，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11