一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法技术

一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法，涉及植物基因工程领域，解决了现有基因编辑受限于基因型且需要经过组织培养从而产生大量遗传变异、不利于后代转基因成分的剔除等问题。本发明专利技术以含有基因编辑靶点gRNA以及基因编辑系统元件的转基因植株和具有单倍体诱导效率的植物株系为材料，制备可用于基因编辑的具有工具属性的中间载体；利用中间载体作为父本，诱导植株产生单倍体，同时完成基因编辑；自然或人工加倍后最终获得靶向基因编辑异的植物新品种/系纯合体。该方法在制备基因编辑中间载体工具后，无需进行复杂的遗传转化和组织培养过程，仅通过人工杂交授粉的方法就可以实现对同一植物不同基因型的基因编辑。

【技术实现步骤摘要】
一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法
本专利技术涉及植物基因工程
，具体而言，涉及一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法。
技术介绍
利用基因编辑技术定点敲除不利基因，从而实现目标性状的精准改良，对于提高作物定向遗传改良效率有很大帮助。2016年，精准的植物基因编辑技术被列为十大科技突破之一，基于CRISPR-Cas9的靶向基因工程可以精准的改善农作物特性，在确保粮食的可持续生产方面表现出了巨大的技术优势和市场潜力。玉米研究方面杜邦先锋公司已成功利用该技术得到了糯玉米、磺酰脲类除草剂抗性、雄性不育和叶舌缺失等基因编辑玉米植株。其他作物方面，已经在马铃薯、牵牛花、芥蓝、水稻、大豆等获得重要进展，展现了巨大的商业价值。尽管基因编辑技术已经较为成熟，但目前玉米、高粱等很多植物基因编辑工作仍有很大的技术瓶颈。存在的主要问题是：基因编辑严重依赖于植物遗传转化技术，而遗传转化技术受基因型限制，且由于经历组织培养过程，通常会产生大量的遗传变异，不利于基因编辑后代材料的快速纯化和应用。常用农杆菌介导的遗传转化方法，同一植物不同基因型对农杆菌敏感度显著不同，以玉米为例，常用于遗传转化的HiII和B104等受体材料，技术优化后转化效率可达到10％左右，但商业化的自交系几乎无法转化成功。高粱、大豆等其他植物也存在类似现象。另一种常用的基因枪介导的方法，同样需要经历繁杂的组织培养再生程序，组培再生也受限于基因型。此外，由于基因枪是物理轰击，轰击细胞损伤较大，细胞内基因碎片化严重，不利于基因编辑后代转基因成分剔除。
技术实现思路
为了解决现有基因编辑受限于基因型且需要经过组织培养从而产生大量遗传变异、不利于后代转基因成分的剔除等问题，本专利技术提供一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法。该方法不依赖于基因型且不需要经过复杂的组织培养，可以快速实现对植物基因型的基因编辑，尤其可以解决难转化基因型植物基因的编辑。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法，以含有基因编辑功能元件的转基因植物株系和具有单倍体诱导效率的植物株系作为基础材料，制备用于基因编辑的具有工具属性的基因编辑中间载体工具，利用该基因编辑中间载体工具，通过杂交同时实现植物单倍体诱导和目标基因编辑，所述基因编辑功能元件包含具有引导基因编辑酶到目标靶点的gRNA序列。作为优选的实施方式，本专利技术的一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法，主要包括以下步骤：步骤一、构建一种含有基因编辑功能元件的植物表达载体，该植物表达载体进入植物体内后能够实现对目标基因的有效编辑；步骤二、以能够遗传转化的植物材料作为受体材料，利用构建的植物表达载体，进行植物遗传转化，培育转基因植物植株；步骤三、含有基因编辑功能元件的转基因植物株系与具有单倍体诱导效率的植物株系进行杂交，产生F1代植株和后代衍生材料，命名为基因编辑中间载体工具；步骤四、以基因编辑中间载体工具作为父本工具，对目标编辑植物株系进行授粉，获得杂交后代；步骤五、杂交后代材料筛选获得单倍体，种植在温室或田间，单倍体植株加倍，去除杂合体和非整倍体；步骤六、基因型分析，PCR测序鉴定获得基因编辑植株；步骤七、自交授粉后获得非转基因、目的基因发生编辑的植物双单倍体纯合株系。作为优选的实施方式，所述植物表达载体含有除草剂草铵膦抗性和基因编辑功能元件。作为优选的实施方式，基因编辑功能元件的启动子优选但不限制为Yao-promoter等在花粉和合子中高表达的启动子，更进一步优选为在精细胞中高表达的启动子。作为优选的实施方式，所述基因编辑功能元件可以选择CRISPR-Cas9、CRISPR-cpf1、转录激活样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)和锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease，ZFN)等。作为优选的实施方式，步骤二中，所述受体材料为玉米品系、水稻品系、高粱品系或大豆品系。作为更优选的实施方式，所述玉米品系为HiII或B104等，所述高粱品系为吉2731或keller等，所述水稻品系为吉粳88或日本晴等，所述大豆为Williams82或沈农9号等。上述植物特征为具有可利用现有的组织培养遗传转化方法容易实现外源基因转入的特点。作为优选的实施方式，步骤二中，所述植物遗传转化方法采用农杆菌介导的植物遗传转化方法。作为优选的实施方式，步骤五中，采用选择小苗进行流式细胞仪检测方法或采用幼胚颜色筛选方法进行单倍体筛选。作为优选的实施方式，步骤五中，采用除草剂涂抹方法，或采用Bar检测试纸进行检测，然后进行转基因载体元件PCR测序确认方法，或采用全基因组测序方法实现杂合体的去除。作为优选的实施方式，步骤六中，采用编辑靶点PCR测序方法或采用全基因组测序方法进行基因型分析。本专利技术还提供了一种基因编辑中间载体工具，该基因编辑中间载体工具同时具有植物单倍体诱导和目标基因编辑功能。本专利技术提供了上述基因编辑中间载体工具的制备方法，主要包括以下步骤：步骤一、构建一种含有基因编辑功能元件的植物表达载体，该植物表达载体进入植物体内后能够实现对目标基因的有效编辑；步骤二、以能够遗传转化的植物材料作为受体材料，利用构建的植物表达载体，进行植物遗传转化，培育转基因植物植株；步骤三、得到的转基因植物植株中选择具有基因编辑能力的的单株A作为父本，选择具有单倍体诱导能力的株系B作为母本进行杂交，产生的F1代或在后代中进一步筛选具有植物单倍体诱导能力且含有转基因成分的阳性植株即为基因编辑中间载体工具。专利技术原理：众所周知，双单倍体(DH)育种技术是利用自然发生或人工培育的单倍体植株，经人工或自然加倍获得纯合的二倍体植株。利用DH育种技术选系的优势在于加速选育进程，可实现被选自交系一代纯合，与传统自交选育的需要6-7世代相比，具备明显的技术优势。DH育种技术主要包括三个环节，即单倍体的诱导、单倍体筛选、单倍体加倍。目前常用的单倍体诱导多采用利用诱导系进行杂交授粉，后代筛选单倍体的方法。以玉米为例，世界上上第一个选育成功和目前普遍适用的单倍体诱导系Stock6，诱导可产生2.52％的单倍体植株。目前国内外通过杂交改良的方法已经获得多个单倍体诱系，诱导率约为5～15.9％。本专利技术在开展玉米单倍体诱导基础研究过程中，意外的发现，当赋予单倍体诱导系基因编辑功能后，利用该材料进行单倍体诱导，不但可以完成单倍体诱导，还可以对单倍体直接进行基因编辑。本专利技术还发现单倍体编辑后，转基因成分并不进入单倍体植株体内，并且基因编辑后的单倍体加倍后可以直接形成一个的目标基因编辑的纯合的新品系。基于该发现，本专利技术进一步设计了通过制备具有工具属性的基因编辑中间载体开展植物基因编辑的方法，不通过遗传转化即可实现难转化基因型植物的快速基因编辑。该方法不仅限于玉米使用，还适用于所有具有单倍体诱导能力和可以人工授粉的植物，本专利技术加快了植物基因编辑的研发速度，解决了植物基因编辑中受基因型限制的技术难题。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过制备含有基因编辑元件且具有单倍体诱导能力的具有工具属性的基因编辑中间载体工具，利用该基因编辑中间载体工具对靶向编辑植株进行授粉，最终实现单倍体诱导、基因编辑和单倍体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法，其特征在于，以含有基因编辑功能元件的转基因植物株系和具有单倍体诱导效率的植物株系作为基础材料，制备用于基因编辑的具有工具属性的基因编辑中间载体工具，利用该基因编辑中间载体工具，通过杂交同时实现植物单倍体诱导和目标基因编辑，所述基因编辑功能元件包含具有引导基因编辑酶到目标靶点的gRNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种不依赖于基因型的植物基因编辑方法，其特征在于，以含有基因编辑功能元件的转基因植物株系和具有单倍体诱导效率的植物株系作为基础材料，制备用于基因编辑的具有工具属性的基因编辑中间载体工具，利用该基因编辑中间载体工具，通过杂交同时实现植物单倍体诱导和目标基因编辑，所述基因编辑功能元件包含具有引导基因编辑酶到目标靶点的gRNA序列。2.根据权利要求1所述的植物基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、构建一种含有基因编辑功能元件的植物表达载体，该植物表达载体进入植物体内后能够实现对目标基因的有效编辑；步骤二、以能够遗传转化的植物材料作为受体材料，利用构建的植物表达载体，进行植物遗传转化，培育转基因植物植株；步骤三、含有基因编辑功能元件的转基因植物株系与具有单倍体诱导效率的植物株系进行杂交，产生F1代植株和后代衍生材料，命名为基因编辑中间载体工具；步骤四、以基因编辑中间载体工具作为父本工具，对目标编辑植物株系进行授粉，获得杂交后代；步骤五、杂交后代材料筛选获得单倍体，种植在温室或田间，单倍体植株加倍，去除杂合体和非整倍体；步骤六、基因型分析，PCR测序鉴定获得基因编辑植株；步骤七、自交授粉后获得非转基因、目的基因发生编辑的植物双单倍体纯合株系。3.根据权利要求2所述的植物基因编辑方法，其特征在于，所述植物表达载体含有除草剂草铵膦抗性和基因编辑功能元件。4.根据权利要求2所述的植物基因编辑方法，其特征在于，所述基因编辑功能元件为CRISPR-Cas9、CRISPR-cpf1、转录激活样效应因子核酸酶或锌指核酸酶。5.根据权利要求2所述的植物基因编辑方法，其特征在于，步骤二中，所述受体材料为玉米品系、水稻品系、高粱品系或大豆品系。6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘相国，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22