一株暹罗芽孢杆菌及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一株暹罗芽孢杆菌及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，微生物学与食品安全领域；该暹罗芽孢杆菌可通过固定搭载在稻壳生物质碳上制备成土壤修复剂，用于叶菜种植体系中土壤源塑化剂残留污染的修复，以及降低该土壤源塑化剂向叶菜可食用部分的吸收转运。该修复剂成分中的芽孢杆菌属于土壤常见益生菌，和生物质炭一样广泛用于制做生物质肥料，所以该土壤修复剂非常适用于叶菜的土培种植，实现绿色安全生产。

【技术实现步骤摘要】
一株暹罗芽孢杆菌及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用
本专利技术涉及一株暹罗芽孢杆菌（Bacillussiamensis）及其在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，即针对叶菜种植体系中土壤源塑化剂邻苯二甲酸二丁酯残留污染的土壤利用该暹罗芽孢杆菌制备修复剂并加以应用方法，属于微生物学与食品安全领域。技术背景塑化剂（plasticizer）又称增塑剂，是一类无色油状合成化合物，广泛用于各类塑料产品生产，如涂料、塑料包装盒或包装膜、医护管件、可伸缩玩具、农药以及聚氯乙烯材料等。作为一种代表性的塑化剂，邻苯二甲酸二丁酯（Dibutylphthalate，DBP）的产量高达每年数百万吨，同时其极容易释放进入环境，污染生态圈及食物链。由于DBP的挥发性，以及其与塑料产品之间的弱化学键，使得食品在包装和运输过程中与塑料制品接触会污染上塑化剂，但最具危害的还是作物在生产过程中吸收进体内的塑化剂残留。叶菜中残留积累的DBP是人类DBP暴露的主要来源（Zhang,Y.,Tao,Y.,Zhang,H.,Wang,L.,Sun,G.,Sun,X.,Erinle,K.,Feng,C.,Song,Q.,Li,M.,2015.Effectofdi-n-butylphthalateonrootphysiologyandrhizospheremicrobialcommunityofcucumberseedlings.J.Hazard.Mater.289,9-17.），长期接触积累会致癌，干扰内分泌系统以及降低雄性生育能力。因此，邻苯二甲酸二丁酯已被美国环境保护署（USEPA）列为一种重点污染物。目前已经报道的土壤修复剂主要聚焦在土壤重金属污染治理修复，以及利用有益微生物群来提高土壤的肥力，专门针对塑化剂，特别是邻苯二甲酸二丁酯土壤污染进行治理的修复剂还未见报道。随着人们生活水平的提高，对新鲜蔬菜的需求也越大。而温室塑料大棚及化学农药的使用目前是保障叶菜供应的最高效手段，这就不可避免地导致栽种土壤中塑化剂的污染。叶菜的快速生长特性决定了它会通过根部组织从土壤中吸收大部分水分和养料，这伴随着塑化剂残留进入叶菜可食用部分，最终被人类食用而危害人体健康。鉴于此，探索有效修复土壤塑化剂残留污染及寻找阻断塑化剂从栽种土壤进入叶菜中的方法对于生态环境保护，绿色农业生产及人类可持续发展都显得十分重要。暹罗芽孢杆菌（Bacillussiamensis）自2010年首次分离于泰国暹罗，目前研究较少，现有报道中，其对梨轮纹病、软腐病、番茄疫霉根腐病菌具有一定的防治效果，但在降解土壤中邻苯二甲酸二丁酯的应用尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一株暹罗芽孢杆菌（Bacillussiamensis），该菌株可针对土壤主要塑化剂邻苯二甲酸二丁酯进行降解，并可进一步制备为修复剂，能够有效降解残留于栽种土壤中的塑化剂污染，进而减少其向叶菜中的吸收转移，同时要保证不影响叶菜植株的正常生长，以及不引入其他污染源。本专利技术首先提供了一株保藏号为CGMCCNO:16234的暹罗芽孢杆菌（Bacillussiamensis），申请人将其自命名为T7，芽孢杆菌属；该菌株分离自多年生本草植物酸模体内，菌株呈棒杆状，表面分泌多糖类物质，单个菌株之间能够粘附在一起，菌量大时形成生物膜状而存在，是土壤环境中常见有益菌属,多数对动植物无害。其次，本专利技术提供了上述保藏号为CGMCCNO:16234的暹罗芽孢杆菌在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，特别是降解土壤邻苯二甲酸二丁酯污染中的应用。第三，本专利技术提供了一种针对邻苯二甲酸二丁酯土壤污染的高效修复剂。该修复剂中包含保藏号为CGMCCNO:16234的暹罗芽孢杆菌，同时选择搭载媒介、搭载固定条件的优化以及土壤施用比例等技术问题。具体包括：（1）稻壳生物质炭的制备：选取水稻脱粒后的生物质废料稻壳，暴晒风干至少一周后，再放入120℃烘箱干燥24小时，以达到完全脱水状态；然后将稻壳生物质放入SG-GL1100K高温炉中，500℃裂解4小时，得到生物质炭原料；最后对生物质炭原料进行研磨、筛选至粒径为0.154mm，然后于121℃高压蒸汽灭菌20min，即获得稻壳生物质炭；该稻壳生物质炭的制备方法是在对现有制备方法的优化，前期进行长期风干，烘箱干燥可以确保稻壳完全脱水，这样在高温条件下就不会产生烟雾；而SG-GL1100K高温炉带有抽真空装置，使得稻壳生物质原料在真空状态下裂解，全程不排出任何烟雾废气，这比传统的马弗炉更能均匀而彻底的裂解生物质原料。在前期预实验中，申请人发现对于Bacillussiamensissp.T7而言，稻壳生物质炭的粒径在0.154mm时所吸附搭载的生物量最大，所以在制备土壤修复剂时统一将生物质炭研磨成粒径为0.154mm；（2）制备菌悬液：利用LB培养基过夜培养保藏号为CGMCCNO:16234的暹罗芽孢杆菌T7菌株，菌体经过离心（5000rpm，15min,4℃）并用无菌磷酸缓冲液（PBS，pH7.0）洗涤三遍，然后用PBS重悬成OD6001.5左右的菌悬液；（3）制备土壤修复剂：将步骤（2）获得的菌悬液与步骤（1）获得的稻壳生物质炭混合，混合比例为每1克稻壳生物质炭（干重）与200毫升菌悬液混合，然后添加氯化钙至0.01摩尔每升（菌液），添加叠氮化钠至0.2克每升（菌液）；随后将混合物置于30摄氏度摇床中，低速（80转每分钟）进行物理吸附固定24小时；然后用200目的筛子过滤菌液，再用无菌PBS冲洗微生物搭载剂（即稻壳生物质炭）三遍，以去除稻壳生物质炭表面没有吸附的T7菌株，最后将该搭载上T7菌的稻壳生物质炭放置在烘箱中35摄氏度干燥24小时，即获得土壤修复剂。第四，本专利技术提供了上述土壤修复剂在降解叶菜种植体系中土壤源塑化剂残留污染的修复应用，以及降低该土壤源塑化剂向叶菜可食用部分的吸收转运中的应用。本专利技术从植物体内分离筛选出了一株暹罗芽孢杆菌（Bacillussiamensis），首次发现了其邻苯二甲酸二丁酯降解特性，该菌株区别其目前已知的植物促生长及生物防治，可防治多种作物真菌霉菌病害。其次，申请人将该菌株搭载在生物质炭上制备成土壤修复剂，充分发挥其DBP降解的功能，以弥补当前有效阻断塑化剂从栽种土壤进入叶菜中方法的空白实现绿色安全种植，既降解叶菜种植体系中土壤源塑化剂残留污染，又降低该土壤源塑化剂向叶菜可食用部分的吸收转运，减少人们因为食用叶菜而暴露DBP的危害。附图说明图1为暹罗芽孢杆菌（Bacillussiamensis）T7的扫描电镜显微图。图2为暹罗芽孢杆菌T7对邻苯二甲酸二丁酯的降解功能验证结果示意图。图3为塑化剂修复剂外表面扫描电镜显微图。图4为该微生物修复剂对土壤中残留邻苯二甲酸二丁酯修复功能展示。图5为该微生物修复剂对减少叶菜种植过程中塑化剂污染的效果示意。具体实施方式实施例所涉及的培养基：LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化钠，pH7.0；无机盐液体培养基:MgSO4·7H2O(0.4g),FeSO4·7H2O(0.2g),K2HPO4(0.2g),(NH4)2SO4(0.2g),andCaSO4,(0.08g),去离子水1L,pH7.0~7.2;无机盐固本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），其保藏编号为CGMCC NO:16234。

【技术特征摘要】
1.一株暹罗芽孢杆菌（Bacillussiamensis），其保藏编号为CGMCCNO:16234。2.如权利要求1所述暹罗芽孢杆菌在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。3.一种含有如权利要求1所述暹罗芽孢杆菌的土壤修复剂。4.根据权利要求3所述的土壤修复剂，其特征在于，所述土壤修复剂包括生物质炭和暹罗芽孢杆菌液。5.根据权利要求4所述的土壤修复剂，其特征在于，所述土壤修复剂是通过如下方法获得的：将完全脱水状态的稻壳置于500℃裂解4小时，研磨后灭菌，获得稻壳生物质炭；（2）将LB培养基中过夜培养的暹罗芽孢杆菌株离心后，以PBS洗涤，再用PBS重悬成OD60...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯发运，余向阳，张猛，万群，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32