生产1,5-戊二胺的方法技术

本申请提供了一种利用工程化宿主细胞发酵生产1,5‑戊二胺的方法。所述方法能够利用其它单糖，成本低廉，且产率高。

Method of Producing 1,5-Pentadiamine

This application provides a method for the production of 1,5-pentadiamine by fermentation of engineered host cells. The method can utilize other monosaccharides with low cost and high yield.

【技术实现步骤摘要】
生产1，5-戊二胺的方法
本专利技术涉及利用工程化宿主细胞发酵生产1,5-戊二胺的方法。更具体的，本专利技术涉及利用转化有赖氨酸脱羧酶的工程化宿主细胞生产1,5-戊二胺的方法。
技术介绍
赖氨酸脱羧酶(lysinedecarboxylase,简称LDC,分类号为EC4.1.1.18)广泛存在于微生物、动物和高等植物中，其可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO2。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法戊二胺生产主要采用微生物发酵生产和微生物体外酶催化生产戊二胺。利用微生物发酵生产或微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺时，使用较多的是根据乳糖操纵子来构建赖氨酸脱羧酶基因表达盒，中国专利CN105441497A通过构建结构为LacIq-IPTG/乳糖诱导型启动子(Ptac)-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的表达盒，使得赖氨酸脱羧酶基因分泌表达。研究人员发现利用L-阿拉伯糖或者L-鼠李糖操纵子来对基因进行表达时，菌株可以利用L-阿拉伯糖和L-鼠李糖作为诱导剂诱导基因表达(WegererA,SunTQandAltenbuchneJ(2008)OptimizationofanE.coliL-rhamnose-inducibleexpressionvector:testofvariousgeneticmodulecombinations.BMCBiotech,8:2)。另外，通过细菌如大肠杆菌基因组分析发现了存在如上所述的可以代谢D-木糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖的结构基因(JindanZhouandKennethE.Rudd(2013)EcoGene3.0NucleicAcidsResearch,41(D1):D613-D624.)。本专利技术通过基因工程手段对宿主细胞进行改造，以实现赖氨酸脱羧酶基因的高效表达和1,5-戊二胺的高产率。
技术实现思路
本专利技术提供了一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：1)提供基因工程化的宿主细胞，所述细胞中含有赖氨酸脱羧酶基因以及L-阿拉伯糖或者D-木糖或者L-鼠李糖单糖调控元件；2)向培养基中加入相应的单糖。在一些实施方式中，加入的单糖L-阿拉伯糖或者D-木糖或者L-鼠李糖可以是在培养开始时加入，也可以是在培养过程中加入。在一些实施方式中，所加入的单糖的浓度范围为0.01％～1％w/v(即0.1～10g/L)，优选0.05％～0.5％w/v。在一些实施方式中，L-阿拉伯糖的浓度为0.16～0.5％w/v，优选是0.16～0.2％w/v，例如L-阿拉伯糖浓度是0.16％、0.2％、0.5％w/v。在一些实施方式中，D-木糖的浓度为0.16～0.5％w/v，优选是0.16～0.2％w/v，例如D-木糖浓度是0.16％、0.2％、0.5％w/v。在一些实施方式中，L-鼠李糖的浓度为0.05～0.5％w/v，优选是0.05～0.2％w/v，例如L-鼠李糖的浓度是0.05％、0.1％、0.16％、0.2％、0.5％w/v。本专利技术中，所提供的基因工程化的宿主细胞可以利用除葡萄糖之外的单糖L-阿拉伯糖或者D-木糖或者L-鼠李糖作为碳源生长，并生产赖氨酸脱羧酶。在一些实施方案中，可以感应葡萄糖之外的单糖的调控元件可以是在宿主细胞的染色体基因组中编码的，也可是重组的或人工合成的。本文所选的宿主细胞可以是微生物、植物或动物细胞，优选微生物细胞。在一些实施方案中，选择作为宿主的微生物可以是大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，优选大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌。本专利技术中，细胞可以感应的除葡萄糖之外的单糖的调控元件是L-阿拉伯糖，D-木糖或L-鼠李糖的调控元件。在一些实施案例中，赖氨酸脱羧酶(LDC)的基因可以是来自微生物、动物或植物的细胞，包括但不局限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、天蓝色链霉菌、蜂房哈夫尼菌、谷氨酸棒状杆菌或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiellaoxytoca)等。优选地，赖氨酸脱羧酶(LDC)基因是来自于大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶基因SEQIDNo:4。另外，赖氨酸脱羧酶也可以来自于上述菌株经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段(保留了赖氨酸脱羧酶活性的截短形式的蛋白片段)。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因的序列为SEQIDNO:4的序列或其编码具有赖氨酸脱羧酶活性的肽的变体或同源序列。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因cadA的序列是与SEQIDNO:4具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同源性的序列。在一些实施例中，赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQIDNO:3的序列或其具有赖氨酸脱羧酶活性的变体。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列是与SEQIDNO:3具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同源性且保持赖氨酸脱羧酶活性的序列。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因的上游序列是经过优化的序列，即上游的序列5’-GACCATGATTACGAATTCGAGCTC-3’(SEQIDNo:24)替换为5’-GACCATGATTACGAATTCGTTTTTTTGGGAATTCACACACAGGAGGAGCTC-3’(SEQIDNo:25)。在本文中，L-阿拉伯糖调控元件、D-木糖调控元件和L-鼠李糖调控元件均可以为任何已知的元件序列。在一些实施方案中，L-阿拉伯糖调控元件的序列为SEQIDNO:11。在一些实施方案中，D-木糖调控元件包含序列为SEQIDNO:14的木糖启动子和序列为SEQIDNO:17的木糖调控蛋白编码基因及其核糖体结合位点(RBS)。在一些实施方案中，L-鼠李糖调控元件的序列为SEQIDNO:20。在一些实施方式中，引入的赖氨酸脱羧酶基因和单糖调控元件在一个载体上。在一些实施方案中，所构建的含有可以感应葡萄糖之外的单糖的元件的重组质粒载体由在宿主细胞中可复制骨架质粒衍生而成。可复制骨架质粒可以是能够在宿主菌中复制的任何一种质粒。在一个实施例中，稳定的重组表达质粒可以是由一个可以在大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌中复制的骨架质粒衍生而来的，骨架质粒包括但不局限于，pUC(例如pUC18和pUC19)、pBR322质粒和他们的衍生质粒。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因和L-阿拉伯糖调控元件包含在载体pCIB61中。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因和D-木糖调控元件包含在载体pCIB63中。在在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因和L-鼠李糖调控元件包含在载体pCIB64中。本专利技术的方法还包括将所构建的包含可以感应除葡萄糖之外的单糖的元件以及赖氨酸脱羧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产1,5‑戊二胺的方法，所述方法包括：1)提供基因工程化的宿主细胞，所述细胞中含有赖氨酸脱羧酶基因以及L‑阿拉伯糖或者D‑木糖或者L‑鼠李糖单糖调控元件；2)向培养基中加入相应的单糖。

【技术特征摘要】
1.一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：1)提供基因工程化的宿主细胞，所述细胞中含有赖氨酸脱羧酶基因以及L-阿拉伯糖或者D-木糖或者L-鼠李糖单糖调控元件；2)向培养基中加入相应的单糖。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述相应单糖的浓度是0.01％～1％w/v，优选0.05％～0.5％w/v。3.根据权利要求2所述的方法，其中，L-阿拉伯糖的浓度为0.16～0.5％w/v，优选是0.16～0.2％w/v，例如L-阿拉伯糖浓度是0.16％、0.2％、0.5％w/v。4.根据权利要求2所述的方法，其中，D-木糖的浓度为0.16～0.5％w/v，优选是0.16～0.2％w/v，例如D-木糖浓度是0.16％、0.2％、0.5％w/v。5.根据权利要求2所述的方法，其中，L-鼠李糖的浓度为0.05～0.5％w/v，优选是0.05～0.2％w/v，例如L-鼠李糖的浓度是0.05％、0.1％、0.16％、0.2％、0.5％w/v。6.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，所述宿主细胞是微生物、植物或动物细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述微生物是大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。8.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，赖氨酸脱羧酶基因来自微生物、动物或植物的细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、天蓝色链霉菌、蜂房哈夫尼菌、谷氨酸棒状杆菌或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiellaoxytoca)。9.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，所述赖氨酸脱羧酶基因的序列为SEQIDNO:4的序列或其编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲，周豪宏，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术研发中心有限公司，凯赛生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31