USH1G基因在制备抗胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了USH1G基因在制备抗胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用。本发明专利技术通过临床胃癌临床样本组织芯片，免疫组化证实，USH1G在胃癌中表达增高，且与预后相关；同时通过临床胃癌组织样本，免疫印迹实验发现，USH1G在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织；此外通过体外细胞实验改变USH1G基因表达会影响胃癌细胞的生物学行为，利用特异性的siRNA序列有效抑制人胃癌细胞株USH1G蛋白的表达后，胃癌细胞株的侵袭能力降低。USH1G作为胃癌基因诊疗的靶点，在制备精准医疗的诊断试剂盒和用于治疗高表达USH1G的胃癌的药物中，将具有广泛的应用。

【技术实现步骤摘要】
USH1G基因在制备抗胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
本专利技术属于癌症精准医疗药物
，具体涉及USH1G基因在制备抗胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用。
技术介绍
胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一。胃癌的发病率和致死率在亚洲，尤其是中国、日本和韩国特别高。随着手术、化疗、放疗水平的提高，胃癌患者的生存率大幅提高。但是胃癌起病隐匿，缺乏特异性表现，早期诊断率低，确诊时多为中晚期，这些特征严重影响了胃癌患者的长期存活。随着对肿瘤发病机制分子水平研究的深入和分子生物学技术的发展，肿瘤治疗进入了一个全新分子靶向治疗时代。与传统全身化放疗相比，肿瘤靶向治疗可以在无创或微创条件下高效、针对性地杀伤肿瘤细胞，具有患者易于接受、不良反应小，正常组织损伤少的优点。针对胃癌发生、发展有关的信号通路开发靶向药物应用于临床成为胃癌治疗研究的新热点。现已研发的一些针对不同靶点的药物在应用中显示了较好的疗效趋势，目前获准上市的胃癌靶向药物仅包含曲妥珠单抗(赫赛汀)，该药针对的是Her2蛋白高表达的患者。第二种靶向药物是雷莫芦单抗，针对的是VEGFR2。探寻新的生物分子标志物来预测胃癌的进展，指导精准治疗，以改善患者生活质量，延长患者生命，具有重要的实际临床意义。USH1G蛋白(UshersyndrometypeIG，USH1G)是一种含锚蛋白重复序列和SAM域的支架蛋白，原名为SANS(scaffoldproteincontainingankyrinrepeatsandSAMdomain，SANS)。目前仅有研究显示此基因突变能够引发IG型Usher综合症，故改名为USH1G。Usher综合征是一种常染色体隐性遗传疾病，临床表现为感音神经性听力损害和进行性视力丧失。USH1G的突变影响自身和myosinvjia、USH1C以及CDH23的相互作用，从而导致疾病发生。但USH1G与人类恶性肿瘤的关系未见文献报道。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种USH1G基因在制备用于胃癌诊断或预后判断的试剂盒中的应用。本专利技术的另一目的是提供一种上述USH1G基因在制备用于治疗胃癌药物中的应用，满足抗胃癌药物的使用需求。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：USH1G基因(NM173477)在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的应用。USH1G基因在制备用于胃癌预后判断的诊断试剂盒中的应用。USH1G基因在制备用于治疗胃癌的药物中的应用。所述药物以USH1G基因为靶点设计而成。所述药物包括以下三条siRNA序列：USH1G#1：5’-CTGGGATGAGCTCGATTTA-3’；USH1G#2：5’-ATGGTGTTCCGCAGAAATT-3’；USH1G#3：5’-ACATGGAATGCGTGCGCTA-3’；本申请回顾性收集701例胃病患者(包括慢性胃炎、肠化生、上皮内瘤样病变和胃癌)病理切片，发现USH1G蛋白在胃癌中表达明显高于非癌症组。统计其中具有完整临床与预后信息的520例胃癌病理组织芯片中USH1G的蛋白表达差异，并建立Cox比例风险回归模型。发现USH1G与胃癌TNM分期晚，预后差密切相关。同时在临床胃癌组织样本中发现USH1G在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织；此外体外实验干扰USH1G表达可抑制胃癌细胞的侵袭、迁移和黏附能力。这些临床数据和实验结果均表明，USH1G可成为胃癌精准诊疗提供有价值的新靶点。有益效果：与现有的技术相比，本专利技术采用组织芯片和免疫组化技术检测胃癌中USH1G的表达情况，发现USH1G蛋白的表达在胃癌组织中明显升高，且USH1G高表达组患者预后较差。同时获取临床胃癌组织样本，发现USH1G在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织；此外通过Westernblot、划痕实验、Transwell小室、细胞黏附等技术，在体外试验中研究USH1G基因对胃癌细胞生物学行为的影响。结果发现特异性的siRNA序列可以有效抑制人胃癌细胞中USH1G蛋白的表达。RNA干扰抑制USH1G表达后，胃癌细胞侵袭迁移和黏附能力下降。USH1G是胃癌基因诊疗的一个靶点，在用于制备胃癌转移诊断试剂盒和治疗药物中将具有广泛的应用。附图说明图1是IHC观察USH1G在胃癌及癌旁组织中的表达结果图；图中，A为中低度分化胃癌组织，B为高度分化胃癌组织，C为高级上皮内瘤变，D低级上皮内瘤变，E为正常胃粘膜上皮组织；图2是USH1G的表达与胃癌患者预后的关系图；图3是比较12对胃癌及癌旁组织中USH1G的表达水平结果图；图中，A利用Westernblot法检测胃癌及其癌旁组织中USH1G的蛋白水平，HistoneH3为内参，B是A的量化柱形图；图4是siRNA干扰胃癌细胞后，USH1G的表达情况结果图；图中，A是将siRNANC(NegativeControl)和USH1GsiRNA干扰片段转染至胃癌细胞HGC27，B指转至AGS，48h后检测细胞中USH1G的蛋白表达水平；图5是Transwell小室实验观察USH1G对胃癌细胞侵袭能力的影响结果图；图6是划痕实验观察USH1G对胃癌细胞迁移能力的影响结果图；图7是细胞基质黏附实验观察USH1G对胃癌细胞侵袭能力的影响结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。以下实施例中使用的主要试剂为：(1)二步法免疫组化检测试剂盒：基因科技上海有限公司；兔抗人USH1G多克隆抗体(免疫组化试验用)：abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(免疫组化试验用)：美国CST公司；0.01mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)：北京中山生物技术有限公司；DAB：美国Sigma公司；二甲苯、中性树胶等由病理科提供。DAB工作液：DAB粉剂20mg溶解于50mL0.01mol/LPBS中，再用定性滤纸过滤，保存在棕色瓶中(使用前配制)；根据需要加入由0.01mol/LPBS液配制的3％H2O2数滴帮助显色。(2)细胞培养及转染所需试剂：DMEM高糖、1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶：美国HyClone公司；LipofectamineTM2000：美国Invitrogen公司；RPMI-1640完全培养液：分别加入RPMI-1640与胎牛血清混匀，使其终浓度分别为90％，10％，1×，4℃保存。细胞冻存液：将RPMI-1640完全培养液、胎牛血清和DMSO按5：4：1比例配制，4℃保存。(3)Westernblot实验试剂：1×TBST：取Tris2.42g、NaCl8.0g、Tween-200.5mL，混合溶解，定容至1L，常温保存。1×转膜Buffer：甘氨酸14.4g、Tris3.03g，加适量双蒸水搅拌溶解，再加200mL无水甲醇，定容至1L，混合均匀(用时配制)。封闭液100mL：取脱脂奶粉5g，加入100mL1×TBST，混合溶解即可(需用时配制)。BCA蛋白测定试剂盒：Biosharp；兔抗人USH1G多克隆抗体(Westemblot试验用)：abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(Westemblot试验用)：美国CST公司；ECL发光试剂盒：美国Thermofisher公司。以下实施例中使用的主要仪器如下：组织芯片制作仪：美国Beeche本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.USH1G基因在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的应用。

【技术特征摘要】
1.USH1G基因在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的应用。2.USH1G基因在制备用于胃癌预后判断的诊断试剂盒中的应用。3.USH1G基因在制备用于治疗胃癌的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物以USH1G基因为靶点设计而成。5.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丹，朱俐，张筱静，黄剑飞，杨磊，
申请(专利权)人：南通大学，南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32