蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用。本发明专利技术利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了肝内胆管癌患者相关血清，在较短时间内比较了肝内胆管癌病人和健康人样品中的不同，结果发现MUC13蛋白的表达水平在肝内胆管癌病人中的表达水平明显高于健康人，提示MUC13蛋白可作为肝内胆管癌的候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗肝内胆管癌。试验证明，本发明专利技术提供的血清标志物MUC13的特异性为90％，敏感性为91.67％，具有高特异性和高敏感性的特点。进一步的，本发明专利技术还提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，可用于定性测定人血清中抗MUC13的IgG抗体的水平，有助于肝内胆管癌的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用
本专利技术涉及一种新的、用于早期诊断肝内胆管癌的血清生物标志物，还涉及含有该血清生物标志物的试剂盒。本专利技术属于医药

技术介绍
肝内胆管癌(intrahepaticcholangiocarcinoma,iCCA)是起源于肝内胆道上皮的一种高度恶性肿瘤，在肝脏恶性肿瘤中位于第二位。流行病学研究提示近年来其发病率和致死率在世界范围内呈上升趋势。由于起病隐匿、缺乏有效的肿瘤标志物，且具有早期转移的特点，确诊病人大多处于中晚期，失去根治性手术切除或者肝脏移植的机会。同时，肝内胆管癌对传统的放化疗不敏感，缺乏有效的分子靶向药物，使中晚期肝内胆管癌患者处于“无药可用”的窘境。为了降低死亡率，提高肝内胆管癌的治疗效果，关键是肝内胆管癌的早期发现、早期诊断、早期治疗，然而关于肝内胆管癌的诊断方法是及其有限的。从长远角度来看，为了实现对肝内胆管癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的生物标志物。理想的肝内胆管癌标志物应符合以下5个条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)半衰期短，有效治疗后浓度能够很快的下降，能够较快的反应治疗效果；(4)存在于体液，特别是血液中，易于检测。目前还没有符合上述条件的生物标志物开发出来用于诊断肝内胆管癌，为了实现对肝内胆管癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找。MUC13是膜结合型黏蛋白中的一员，基因定位于染色体3q21.2，由α和β两个亚基组成。α亚基位于细胞外部，由串联重复结构域、表皮生长因子样结构域以及海胆子蛋白精氨酸激酶结构域组成。β亚基位于细胞内部，由TM结构域和细胞质尾结构域组成(PMID:21450906)。MUC13在胃肠道上皮、呼吸系统上皮以及生殖道上皮表面呈低水平表达，而在多种胰腺癌、卵巢癌、肾癌组织中表达明显上调(PMID:11278439)。目前，未见有将MUC13蛋白质作为肝内胆管癌生物标志物的报导。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用及诊断试剂盒，来检测人血清中的抗蛋白质MUC13的IgG抗体的水平，作为辅助肝内胆管癌早期诊断的一种手段，以提高肝内胆管癌早期诊断的敏感性和特异性。为达到上述目的，本专利技术所采用了以下技术手段：本专利技术专利技术人前期利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了肝内胆管癌相关血清60份(肝内胆管癌病人30份和健康人血清30份)，在较短时间内比较了肝内胆管癌病人和健康人样品中的不同，结果发现MUC13蛋白的表达水平在肝内胆管癌病人中的表达水平明显高于健康人，提示MUC13蛋白可作为肝内胆管癌的候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗肝内胆管癌。在上述研究的基础上，本专利技术提出了蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用。进一步的，本专利技术还提出了一种用于肝内胆管癌诊断的试剂盒，所述的试剂盒中包括酶标板、人源蛋白质MUC13、包被缓冲液、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述的人源蛋白质MUC13包被于所述酶标板上。其中，优选的，所述的人源蛋白质MUC13是从酿酒酵母中表达，亲和纯化而得到。其中，优选的，所述的包被缓冲液中含有1.59g/LNa2CO3以及2.93g/LNaHCO3；其中，优选的，所述的标准血清包括标准血清A和标准血清B，所述标准血清A为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述标准血清B为MUC13抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中，浓度为100U/mL。其中，优选的，所述的酶标试剂中含偶联HRP的抗人IgG的二抗，浓度为0.1-1μg/mL。其中，优选的，所述的酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，其中，显色剂A：500mL溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含有TMB350mg、DMSO20mL和柠檬酸·H2O5.1g。其中，优选的，所述的封闭液中含有5g/LBSA、8g/LNaCl、0.2g/LKH2PO4、2.9g/LNa2HPO4·12H2O和0.2g/LKCl。其中，优选的，所述的样品稀释液中含有8g/LNaCl、0.2g/LKH2PO4、2.9g/LNa2HPO4·12H2O和0.2g/LKCl。其中，优选的，所述洗涤液中含有8g/LNaCl、0.2g/LKH2PO4、2.9g/LNa2HPO4·12H2O、0.2g/LKCl和0.5mL/LTween-20；所述终止液为2mol/LH2SO4溶液。其中，优选的，使用所述的试剂盒用于肝内胆管癌诊断时，按照以下方法进行：(1)包被：将纯化的人源MUC13蛋白溶液用包被缓冲液稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；洗涤液洗板3次，甩干；(2)封闭：加入封闭液200μL，室温孵育2h时；洗涤液洗板3次，甩干；(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品用样品缓冲液按照1:100稀释至100μL，加入到各自抗原测定孔板中，注意不要有气泡，将样品加于酶标板孔底部，轻轻晃动混匀，酶标板上加覆膜；(4)孵育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，不用洗涤；(5)加酶：每孔加HRP标记的anti-HumanIgG抗体100μL，37℃反应60分钟。甩净孔中液体，同上洗板5次拍干；(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；(7)终止：依序每孔加终止液50μL，终止反应；(8)结果判定：a.用酶联仪在450nm波长依次测量各孔的光密度单位值(U/mL)＝(A450<样品>-A450<标准血清A>)/(A450<标准血清B>-A450<标准血清A>)其中，A450表示450nm处吸光度；b.血清中抗MUC13值的判定当抗MUC13值≤1.3，则判定为健康，当1.3>抗MUC13值≥2.9则判定为高危，当抗MUC13值>2.9则判定为肝内胆管癌。所述试剂盒中的试剂均可以加加防腐剂，以便于保存。相较于现有技术，本专利技术的有益效果在于：1.提供的血清生物标志物的特异性为90％，敏感性为92％，具有高特异性和高敏感性的特点。2.提供了一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗蛋白质MUC13的IgG抗体的水平，有助于辅助早期诊断肝内胆管癌。附图说明图1为银染鉴定MUC13的表达浓度、纯化状况的示意图。图中：1表示标准BSA溶液浓度为5μg/mL；2表示标准BSA溶液浓度为10μg/mL；3表示标准BSA溶液浓度为25μg/mL；4表示标准BSA溶液浓度为50μg/mL；5表示标准BSA溶液浓度为100μg/mL；6表示经琼脂糖亲和介质(谷胱甘肽)分离纯化后的POG2蛋白质样品(含GST标签)；7表示蛋白质分子量marker。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将随着描述而更为清楚，但该实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.蛋白质MUC13在制备诊断肝内胆管癌的试剂中的应用。2.一种用于肝内胆管癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括酶标板、人源蛋白质MUC13、包被缓冲液、标准血清、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液，其中，所述的人源蛋白质MUC13包被于所述酶标板上。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的人源蛋白质MUC13是从酿酒酵母中表达，亲和纯化而得到。4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的包被缓冲液中含有1.59g/LNa2CO3以及2.93g/LNaHCO3；所述的标准血清包括标准血清A和标准血清B，所述标准血清A为健康人血清稀释于样品稀释液中；所述标准血清B为MUC13抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中，浓度为100U/mL。5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标试剂中含偶联HRP的抗人IgG的二抗，浓度为0.1-1μg/mL。6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶底物溶液为TMB溶液，所述TMB溶液包括显色剂A和显色剂B，其中，显色剂A：500mL溶液中含有醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30v/v％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含有TMB350mg、DMSO20mL和柠檬酸·H2O5.1g。7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的封闭液中含有5g/LBSA、8g/LNaCl、0.2g/LKH2PO4、2.9g/LNa2HPO4·12H2O和0.2g/LKCl。8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液中含有8g/LNaCl、0.2g/LKH2PO4、2.9g/LNa2HPO4·12H2O和0.2g/LKCl。9.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液中含有8g/LNaCl、0....

【专利技术属性】
技术研发人员：裴铁民，肖鹏，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23