一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法技术

本发明专利技术涉及一种含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒、重组菌及谷胱甘肽的合成方法，所述的重组质粒包括GS片段和载体片段；所述的载体片段为pET‑22b。本发明专利技术的重组菌既能够高效表达谷胱甘肽，又能够减少谷胱甘肽的降解，从而使得合成谷胱甘肽的效率提高，生产成本和能耗降低。

【技术实现步骤摘要】
一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法。
技术介绍
谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸缩合得到的一种小分子多肽，其广泛存在于各种生物体内，是微生物及植物生物细胞内最主要含巯基的小分子肽。谷胱甘肽是体内一种重要的抗氧化剂。还原型的谷胱甘肽在活组织中具有许多重要的功能，在肝损伤、眼部疾病、物质代谢，调节细胞凋亡等方面发挥着重要的作用。此外，其在食品保鲜领域也发挥这同样重要的作用，因此国内外医药市场、食品，化妆品领域对于谷胱甘肽的需求也在稳步提升。近年来，随着技术的提升，生产谷胱甘肽的方法也日趋增多，但主要还是以微生物发酵法、化学合成法、溶剂萃取法和酶催化合成法。化学合成的操作步骤复杂，成本高，酶催化合成法的不稳定因素较多，溶剂萃取法的生产效率较低。相对而言，微生物发酵法具有低成本，反应条件温和，生产效率高的优势而逐渐成为了生产谷胱甘肽的主要方法。微生物发酵法是通过向微生物中导入过表达的重组质粒，用以过表达合成谷胱甘肽的酶，从而实现了谷胱甘肽的大量生产。其生产方式简单，只需要在反应体系中加入三种氨基酸后，就能实现氨基酸向谷胱甘肽转化。近年来，随着基因工程及分子生物学的发展，研究者们逐渐发现了一些双功能酶基因，这些基因能够高产谷胱甘肽但又可以无视谷胱甘肽反馈抑制作用。另外，还有研究发现了一些能够降解谷胱甘肽的基因。因此，利用分子生物学技术将这些基因组合起来就可以实现谷胱甘肽的大量生产。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够高效合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法。为解决以上技术问题，本专利技术采取如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒，所述的重组质粒包括GS片段和载体片段；所述的载体片段为pET-22b。优选地，所述的GS片段位于所述的载体片段的T7启动子之下。优选地，所述的GS片段的DNA序列与SEQIDNO.1所示序列至少具有80％的同源性，进一步优选为具有85％以上的同源性，更优选为具有90％以上的同源性，再优选为具有95％以上的同源性，最优选为SEQIDNO.1所示序列。优选地，所述的重组质粒还包括抗性基因片段，用以筛选重组菌。进一步优选地，所述的抗性基因片段为氨苄青霉素抗性基因片段。本专利技术的另一个目的是提供一种所述的含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：A)PCR扩增获得GS片段；B)将所述的GS片段克隆入pET-22b中，得到所述的重组质粒。优选地，步骤A)中，利用PCR技术从pMD19-T-GS中扩增获得GS片段。优选地，步骤A)中，用以进行PCR扩增的引物为：GS-F：CAGCCGGCGATGGCCATGGATATGATCATCGATCGTCTGC；GS-R：TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCGGAAACAGTTTTGCCAGAA。本专利技术的第三个目的是提供一种用于合成谷胱甘肽的重组菌，所述的重组菌包括所述的重组质粒和累积谷胱甘肽的基因缺陷型菌株。优选地，所述的累积谷胱甘肽的基因缺陷型菌株为敲除三肽酶基因Pept的大肠杆菌。进一步优选地，所述大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。进一步优选地，所述的敲除三肽酶基因Pept的大肠杆菌的制备方法包括以下步骤：A)利用PCR技术从pKD3质粒中扩增获得氯霉素基因片段；B)将所述的氯霉素基因片段电转入大肠杆菌BL21(DE3)中，用以置换Pept基因；C)消除氯霉素基因以实现Pept基因的敲除。本专利技术的第四个目的是提供一种所述的重组菌的制备方法，将所述的重组质粒转化入所述的累积谷胱甘肽的基因缺陷型菌株，得到所述的重组菌。本专利技术的第五个目的是提供一种谷胱甘肽的合成方法，通过对所述的重组菌进行培养，得到所述的谷胱甘肽。优选地，所述的培养的温度为25～35℃，pH为3～7，诱导剂的浓度为0.1～1mmol/L。进一步优选地，所述的培养的温度为28～32℃，pH为4～6，诱导剂的浓度为0.4～0.6mmol/L。进一步优选地，所述的诱导剂为IPTG。优选地，所述的合成方法的具体步骤为：将所述的重组菌接种于培养基中，并加入氨苄青霉素，在35～40℃培养8～12小时，然后接种至培养基中，并加入诱导剂，调节pH为3～7，在25～35℃下进行摇瓶培养，得到所述的谷胱甘肽。由于以上技术方案的实施，本专利技术与现有技术相比具有如下优点：本专利技术的重组菌既能够高效表达谷胱甘肽，又能够减少谷胱甘肽的降解，从而使得合成谷胱甘肽的效率提高，生产成本和能耗降低。附图说明图1是pMD19-T-GS质粒图谱的示意图。图2是pET-22b-GS质粒图谱示意图，GS位于T7强启动子下。图3是PCR扩增获GS的检测结果，其中泳道1为GSPCR扩增产物，M是蛋白标准分子量。图4是Pept基因敲除PCR鉴定结果，其中泳道1为Δpept的PCR扩增产物,泳道2为Pept的PCR扩增产物，M是蛋白标准分子量。图5是GS基因蛋白表达的SDS-PAGE结果，其中3泳道为GS蛋白，1泳道为未加诱导剂，2泳道为DE3诱导后蛋白，M是蛋白标准分子量。图6是谷胱甘肽工程菌不同温度下谷胱甘肽产量结果。图7是谷胱甘肽工程菌不同IPTG浓度下谷胱甘肽产量结果。图8是谷胱甘肽工程菌不同pH下谷胱甘肽产量结果。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork:CoLdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。在本专利技术的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自生工生物公司。在本专利技术的下述实施例中，使用的ClonExpressⅡ，Turbo保真酶来自南京诺唯赞生物科技有限公司。NcoI，XhoI，DNAMarker，均购自TAKARA公司。在本专利技术的下述实施例中，使用的表达载体pET-22b，菌种E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α，为中国药科大学生命中心实验室保存,其中菌种E.coliBL21(DE3)的ATCC编号为BAA-1025TM。在本专利技术的下述实施例中，使用的E.coliBL21(DE3)感受态细胞、E.coliDH5α感受态细胞，按照Invitrogen公司PichiaExpressionKit手册中提供的方法进行。在本专利技术的下述实施例中，使用的LB液体培养基的配方为：1％胰蛋白栋，0.5％酵母浸粉，1％NaCl；使用的摇瓶发酵培养基的配方为：1％胰蛋白栋，0.5％酵母浸粉，1％NaCl。配置固体LB平板培养基时，按照上述配方添加2％琼脂粉。在本专利技术的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，按照《分子克隆：实验室手册》提供的方法进行。实施例1pET-22b-GS表达质粒的构建1.1引物设计根据NCBI报道的GS序列，设计以下2条引物用以扩增GS基因：GS-F：CAGCCGGCGATGGCCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒包括GS片段和载体片段；所述的载体片段为pET‑22b。

【技术特征摘要】
1.一种含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒包括GS片段和载体片段；所述的载体片段为pET-22b。2.根据权利要求1所述的含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒，其特征在于：所述的GS片段位于所述的载体片段的T7启动子之下。3.根据权利要求1所述的含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒，其特征在于：所述的GS片段的DNA序列与SEQIDNO.1所示序列至少具有80％的同源性。4.根据权利要求1所述的含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒还包括抗性基因片段，所述的抗性基因片段为氨苄青霉素抗性基因片段。5.一种如权利要求1至4中任一项所述的含有双功能谷胱甘肽合成基因的重组质粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：A)PCR扩增获得GS片段；B)将所述的GS片段克隆入pET-22b中，得到所述的重组质粒。6.一种用于合成谷胱甘肽的重组菌，其特征在于：所述的重组菌包括权利要求1至4中任一项所述的重组质粒和累积谷胱甘肽的基因缺陷型菌株。7.根据权利要求6所述的用于合成谷胱...

【专利技术属性】
技术研发人员：王郑隆，赵玉成，许激扬，徐继嗣，
申请(专利权)人：张家港市华天药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32