本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用，所述启动子如SEQ ID NO:1的核苷酸序列所示，该工程载体具有启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术构建了SLC1启动子驱动IPT1基因表达载体，实现了IPT1基因在黑暗条件下及叶片衰老时期特异高表达，一方面抑制了叶片在黑暗条件加速衰老的进程；另外，又抑制了植物因年龄造成的衰老进程，即可以实现抵御黑暗促进衰老的过程又使植物正常条件下延缓衰老。本发明专利技术可广泛用于植物IPT1基因表达抑制的相关理论以及植物抵御黑暗、抑制衰老等应用研究。
【技术实现步骤摘要】
一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用
本专利技术属于基因工程
，涉及一种植物叶片相关特性具有诱导的启动子及工程载体，具体涉及一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用。
技术介绍
衰老是植物叶片发育最后一个阶段，在此过程中会发生一系列的生理生化反应，包括叶绿素降解、细胞结构坍塌、营养物质再利用等；植物在生长过程中会面临来自环境的生物或非生物胁迫，如病虫害、长时间弱光/黑暗、干旱、异常温度等，植物在遭受这些胁迫后，会加速叶片衰老进程，营养物质从衰老组织重新分配到果实或幼嫩器官，一定程度上增强了植物适应性，因此，叶片衰老对植物而言又具有积极意义；但是，不正常的叶片衰老(早衰或晚衰)影响作物产量及品质；早衰使植物不能更充分的完成光合作用，有机物积累收到限制；可能造成作物的减产降质；理解并实现人工可控的叶片衰老过程在农业生产中具有重要意义；叶片衰老是一个受内因和外因共同作用的结果，其中弱光或者黑暗能够加速叶片衰老进程，也是重要的影响因素之一；已有研究表明，在光影响的植物衰老过程中，光受体phyB-PIF途径参与其中，另外植物激素如茉莉酸也参与了弱光/黑暗诱导的叶片衰老过程；在实际农业生产中，作物株距或行距较小，作物叶片间相互遮挡，容易产生避荫性效应，叶片早衰脱落，影响产量、品质。因此，使植物能够有效抵抗弱光/黑暗造成的早衰，是农业生产中提高产量、品质的有效手段之一。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术提供一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用，使植物具有抵抗黑暗及衰老的特性。申请人发现了一个转录水平同时被黑暗和衰老上调表达的基因SLC1(AT1G14200),该基因功能尚未被研究；通过PCR手段克隆到该基因的461bp启动子，对该启动子进行了表达分析，通过Qrt-PCR,gus及LUC鉴定，发现该启动子可以被黑暗和衰老同时特异诱导的；因此，申请人制备了以该启动子序列为基础骨架的工程载体；利用该工程载体，将细胞分裂素合成关键酶编码基因IPT1(AT1G68460)重组到该载体中，形成了SLC1启动子驱动的IPT1基因表达；由于SLC1启动子特异的被黑暗和衰老诱导，因此，IPT1基因能够在黑暗和叶片衰老时期特异表达，已有报道，不同作物中IPT过表达可以延缓叶片衰老；因此，在拟南芥中实现了特异抵抗黑暗及年龄诱导的衰老过程。如上文所述，本专利技术所述的一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子如SEQIDNO:1的核苷酸序列所示。优选的，所述启动子含有一段5’UTR序列，位于序列的333位～461位。在后续启动子应用中，为了保证SLC1启动子的驱动效果，在工程载体构建中包含这段5’UTR序列优选的，所述启动子具有真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box，分别位于序列的300位～303位和326位～329位。启动子的制备过程如下：提取野生型拟南芥col基因组DNA，利用SLC1启动子特异引物(proSLC1F:GAATTTAATCAAACACCTTCT；proSLC1R:CACGCTAGTACCCAAAAC)进行PCR扩增；扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,57℃30s,72℃30s，32个循环；step3:72℃10min。反应结束后，回收PCR片段并连接T载体，程序按照试剂公司说明进行；连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取克隆并测序，得到SLC1启动子，即本专利技术所述的启动子。本专利技术所述的启动子在启动拟南芥IPT1基因表达中的应用。本专利技术所述的一种黑暗及衰老特异诱导工程载体，其特征在于：该载体具有权利要求1所述的启动子序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。工程载体的制备过程如下：以野生型拟南芥col基因组DNA为模板，利用SLC1启动子通用载体扩增引物proSLC1-996F:ACATGATTACGAATTCGAATTTAATCAAACACCTTCT；proSLC1-996R:CGATCAATCAGGATCCCACGCTAGTACCCAAAAC)，进行PCR扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,58℃40s,72℃30s，33个循环；step3:72℃10min。片段回收后，通过infusion重组方法连接入载体p996；体系及方法为：SLC1启动子片段2μL；BamH1和EcoRI双酶切后的p996载体2μL；infusion酶1μL；50℃条件下反应15分钟，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a中，测序选择阳性克隆并提取质粒，命名为proSLC1载体，即本专利技术所述的工程载体。该工程载体具有以下特征：(1)SLC1启动子自身含有一段5’UTR序列，可提高转录效率；(2)该工程载体在使用过程中，只需要用BamH1单酶切载体；所有要连入的候选基因在设计引物时只需要加入固定接头：F向引物加接头ACGAATTCCAGGATCC+基因特异引物F向；R向引物加接头CGATCAATCAGGATCC+基因特异引物R向，利用infusion重组技术连入proSLC1工程载体即可使用，方便快捷，利于在实际操作中程序化连入其它相关基因；(3)在多克隆位点后，连接有NOS终止子，该终止子具有广谱性，可广泛用于不同物种中；(4)该工程载体植物抗性标记为抗除草剂基因，可通过简单高效的筛选方法获得阳性材料。本专利技术所述的载体在在调控拟南芥IPT1基因表达中的应用。优选的，将拟南芥IPT1基因全长CDS克隆到载体的BamH1位点处，获得重组载体，将该重组载体转化到农杆菌GV3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，该转基因拟南芥具有抗黑暗及抗衰老的特性。本专利技术中，IPT1基因是细胞素合成关键酶合成基因，已有报道，该基因在植物中过量表达能明显抑制叶片衰老过程，但该基因不是特异在黑暗中表达的，基于此，申请人构建了SLC1启动子驱动IPT1基因表达载体，实现了IPT1基因在黑暗条件下及叶片衰老时期特异高表达，一方面抑制了叶片在黑暗条件加速衰老的进程；另外，又抑制了植物因年龄造成的衰老进程，即可以实现抵御黑暗促进衰老的过程又使植物正常条件下延缓衰老。本专利技术的优点在于：可广泛用于植物IPT1基因表达抑制的相关理论以及植物抵御黑暗、抑制衰老等应用研究。附图说明图1为实施例2中拟南芥叶片在不同黑暗时长内SLC1基因表达指数图；图2为实施例2中拟南芥叶片在不同衰老时长内SLC1基因表达指数图；图3为实施例3中对拟南芥叶片分别进行光处理和黑暗处理后GUS染色对比图；图4为实施例3中对拟南芥叶片在不同衰老时长后GUS染色对比图；图5为实施例3中拟南芥叶片在不同黑暗时长内利用多功能酶标仪测定LUC活性指数图；图6为实施例3中拟南芥叶片在不同衰老时长内利用多功能酶标仪测定LUC活性指数图；图7为实施例4中工程载体图谱；图8为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因材料在相同黑暗处理后的离体叶片表型图；图9为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因材料在相同黑暗处理后的叶绿素含量测定对比图；图10为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因材料在相同黑暗处理后的电导率测定对比图；图11为实施例5中col及proSLC1::I本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子如SEQIDNO:1的核苷酸序列所示。
【技术特征摘要】
1.一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子如SEQIDNO:1的核苷酸序列所示。2.根据权利要求1所述的一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子含有一段5’UTR序列，位于序列的333位～461位。3.根据权利要求1所述的一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子具有真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box，分别位于序列的300位～303位和326位～329位。4.一种权利要求1～3任一项所述的启动子在启动拟南芥IPT1基因表达中的应用。5.一种黑暗及衰老特异诱导...
【专利技术属性】
技术研发人员：张增林，郭永峰，李伟，高晓明，徐萌萌，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37
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