基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的引物组合物和方法。本发明专利技术的引物组合物包括上游引物组和下游引物组，且上游引物组中的各引物分别包括5’端的UID序列和与PCR通用引物对中的一种引物互补的结合区，下游引物组中的各引物分别包括与PCR通用引物对中的另一引物互补的结合区；其中上游引物组中的各引物分别特异性结合至特定基因群组中的至少一种基因的突变位点的上游，和下游引物组中的各引物分别特异性结合至该突变位点的下游。本发明专利技术的方法在很大程度上简化了检测过程并降低检测成本，具有通量高，灵敏度高，特异性高的特点。

【技术实现步骤摘要】
基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒和方法
本专利技术属于基因检测领域，具体地涉及一种基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的引物组合物及方法。
技术介绍
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国常见恶性肿瘤死亡中，结直肠癌患者在男性占第五位，女性占第六位。我国每年结直肠癌新发病例超过25万，死亡病例约14万，新发和死亡病例均占全世界同期结直肠癌病例的20％。因此，降低我国结肠癌的发病率和死亡率是刻不容缓的重大临床科学问题。结直肠癌根治性切除术后5年生存率24％-58％，平均仅为40％，术后复发和转移是其死亡的重要原因。研究发现，结直肠癌发病机理和基因组不稳定性密切相关，主要包括染色体不稳定性(chromosomalinstability，CI)和微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)。微卫星不稳定性是指由于DNA错配修复(MismatchRepair，MMR)导致的细胞的超突变状态，出现新的微卫星等位基因现象。它包括在短串联DNA重复序列(微卫星)中插入和缺失突变，以及整个基因组中的核苷酸替换。MSI是一种用于胃肠道、子宫内膜和结直肠肿瘤的诊断标志物。约15％的结直肠癌患者存在MSI现象，其中典型的遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolerectalcancer，HNPCC)患者90％以上为MSI型，表明MSI可作为判断HNPCC患者的重要标志物；与MSS(微卫星稳定)型的结肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌患者的预后更好，并且二者药物反应也不一样，说明MSI可作为结直肠癌预后的独立预测因子，因此，MSI检测对结直肠癌患者意义重大。最近的研究表明，MSI可能是免疫检查点阻断疗法的一个标记。错配修复是指在含有错配碱基的DNA分子中，使核苷酸序列恢复正常的修复方式。MMR基因家族包含9个基因，主要用来纠正DNA双螺旋上错配的碱基对，还能修复一些因复制打滑而产生的小片段核苷酸插入或缺失。MMR基因突变或启动子甲基化可导致MMR基因功能缺失，从而引起含有错配碱基、核苷酸插入或缺失的DNA分子不能正常修复，最终引起广泛的MSI现象。在检测癌细胞中MSI时，既可以直接检测MSI序列变化，也可以通过检测MMR基因缺失来确定是否发生MSI。临床上主要利用免疫组织化学(IHC)染色或聚合酶链式反应(PCR)方法检测患者的MSI状态。MMR基因缺陷检测常依赖于免疫组化(蛋白水平)，而MSI检测一般依赖于分子手段，PCR检测(DNA水平)。IHC主要是检测MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)表达情况。免疫组化检测可以直接鉴定出导致MSI发生的MMR缺陷基因，但是约5％-11％的MSI发生并不会出现MMR蛋白的缺陷。某些MMR蛋白错义突变，会损失MMR功能，但能被抗体检测识别，因此这是分子检测的优势。PCR主要是使用特异的引物，对癌组织样本中的微卫星位点进行逐一PCR或多重荧光PCR扩增，扩增产物经过凝胶电泳进行片段大小分析并与正常对照样本相比，查看其序列变化情况，通常对5个位点(NR-27、NR-24、NR-21、BAT-25和BAT-26)进行检测。MSI可以根据程度被分成高微卫星不稳定性(MSI-H)，低卫星不稳定性(MSI-L)或微卫星稳定(MSS)三类。一般来说，若在检测时2个以上的位点是不稳定的，即为MSI-H；如果检测时1个位点不稳定，即为MSI-L；如果没有检测位点是不稳定的，即为MSS。目前，市场上对于遗传性肿瘤的诊断方法多数停留在单个肿瘤单个或几个位点的检测水平，这些方法都存在不同的缺陷，例如PCR方法有操作繁琐、引物或探针设计复杂、结果不易判读、通量低等问题；而多重PCR检测中，不同引物之间有干扰，在引物的选择及浓度上都有较高的要求；免疫组化的方法特异性和可重复性较低，对样本质量要求高，操作也比较复杂。所以，目前的微卫星不稳定的检测方法难以满足目前检测样本数量大、检测位点多、分布广、检测准确性高等检测要求。因此，急需一种新型的检测手段，不仅在实验上要操作简单、快捷，更要有高灵敏度和可重复性，以满足市场和医疗的需求。
技术实现思路
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术提供基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒和方法。本专利技术提高了诊断的敏感性，且可多样本同时测序，在大样本量筛查的同时极大的降低成本。具体地，本专利技术包括以下内容。本专利技术的第一方面，提供一种引物组合物，其包括上游引物组和下游引物组，且所述上游引物组中的各引物分别包括5’端的UID序列和与PCR通用引物对中的一种引物互补的结合区，所述下游引物组中的各引物分别包括与PCR通用引物对中的另一引物互补的结合区；其中所述上游引物组中的各引物分别特异性结合至下述基因群组中的至少一种基因的突变位点的上游，和所述下游引物组中的各引物分别特异性结合至所述突变位点的下游；所述基因群组包括KIT、MSH2、BIRC3、SLC7A8、ZNF2、MAP4K3、REEP5、DEFB105A、DEFB105B、ACVR2A、RNF43、DOCK3、GTF2IP1、LOC100093631、ARHGEF12、NOMO1、PIP5K1A、KIF14(dist.＝4，175bp)和DDX59(dist.＝19，111bp)。在某些实施方案中，所述突变位点包括：KIT基因的BAT25突变、MSH2基因的BAT26突变、BIRC3基因的NR27突变、SLC7A8基因的NR21突变、ZNF2基因的NR24突变、MAP4K3基因的MONO-27突变、REEP5基因的D5S346突变、DEFB105A或DEFB105B基因的(A)9突变、ACVR2A基因的(A)8突变、RNF43基因的(C)7突变、DOCK3基因的(C)7突变、GTF2IP1或LOC100093631基因的(T)13突变、ARHGEF12基因的(T)8(C)5突变、NOMO1基因的(A)9突变、PIP5K1A基因的(T)9(C)6突变、KIF14(dist.＝4，175bp)基因的(T)8突变和DDX59(dist.＝19，111bp)基因的(T)8突变中的至少一种。在某些实施方案中，所述上游引物组选自由序列为SEQIDNo：1-18的引物组成的组；所述下游引物组选自由序列为SEQIDNo：19-36的引物组成的组。本专利技术的第二方面，提供基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的试剂盒，其包括本专利技术第一方面所述的引物组合物。本专利技术的第三方面，提供基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的方法，其包括以下步骤：(1)使组织样本与引物组合物杂交，其中所述引物组合物为根据权利要求1-3任一项所述的引物组合物；(2)在适于DNA聚合酶或DNA连接酶反应的条件下填平间隙缺口，得到靶标DNA；(3)以所述靶标DNA为模板利用PCR通用引物对进行扩增，得到测序文库。在某些实施方案中，基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的方法进一步包括(4)利用二代测序对所述测序文件进行双端测序，得到样本的双端测序数据。在某些实施方案中，基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的方法进一步包括(5)对于所述双端测序数据分别记为R1和R2，并提取R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物组合物，其包括上游引物组和下游引物组，且所述上游引物组中的各引物分别包括5’端的UID序列和与PCR通用引物对中的一种引物互补的结合区，所述下游引物组中的各引物分别包括与PCR通用引物对中的另一引物互补的结合区；其中所述上游引物组中的各引物分别特异性结合至下述基因群组中的至少一种基因的突变位点的上游，和所述下游引物组中的各引物分别特异性结合至所述突变位点的下游；所述基因群组包括KIT、MSH2、BIRC3、SLC7A8、ZNF2、MAP4K3、REEP5、DEFB105A、DEFB105B、ACVR2A、RNF43、DOCK3、GTF2IP1、LOC100093631、ARHGEF12、NOMO1、PIP5K1A、KIF14(dist.＝4,175bp)和DDX59(dist.＝19,111bp)。

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，其包括上游引物组和下游引物组，且所述上游引物组中的各引物分别包括5’端的UID序列和与PCR通用引物对中的一种引物互补的结合区，所述下游引物组中的各引物分别包括与PCR通用引物对中的另一引物互补的结合区；其中所述上游引物组中的各引物分别特异性结合至下述基因群组中的至少一种基因的突变位点的上游，和所述下游引物组中的各引物分别特异性结合至所述突变位点的下游；所述基因群组包括KIT、MSH2、BIRC3、SLC7A8、ZNF2、MAP4K3、REEP5、DEFB105A、DEFB105B、ACVR2A、RNF43、DOCK3、GTF2IP1、LOC100093631、ARHGEF12、NOMO1、PIP5K1A、KIF14(dist.＝4,175bp)和DDX59(dist.＝19,111bp)。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其中所述突变位点包括：KIT基因的BAT25突变、MSH2基因的BAT26突变、BIRC3基因的NR27突变、SLC7A8基因的NR21突变、ZNF2基因的NR24突变、MAP4K3基因的MONO-27突变、REEP5基因的D5S346突变、DEFB105A或DEFB105B基因的(A)9突变、ACVR2A基因的(A)8突变、RNF43基因的(C)7突变、DOCK3基因的(C)7突变、GTF2IP1或LOC100093631基因的(T)13突变、ARHGEF12基因的(T)8(C)5突变、NOMO1基因的(A)9突变、PIP5K1A基因的(T)9(C)6突变、KIF14(dist.＝4,175bp)基因的(T)8突变和DDX59(dist.＝19,111bp)基因的(T)8突变中的至少一种。3.根据权利要求2所述的引物组合物，其中所述上游引物组选自由序列为SEQIDNo：1-18的引物组成的组；所述下游引物组选自由序列为SEQIDNo：19-36的引物组成的组。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：梁羽，刘萌，张思文，
申请(专利权)人：元码基因科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32