一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用技术

一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用。利用磷酸缓冲液重悬发酵培养的表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体，得到全细胞催化剂，再加入离子液体或低共熔溶剂置于水浴摇床进行反应；离子液体或低共熔溶剂占总体积的1%~20%，反应温度30~60℃，转速180 rpm；处理时间0.5~3 h；处理后离心并收集菌体，利用磷酸缓冲液清洗掉残留离子液体/低共熔溶剂，既得通透性增大的全细胞催化剂。本发明专利技术采用离子液体/低共熔溶剂改善全细胞催化剂的通透性，提高胞内酶与底物接触几率。

【技术实现步骤摘要】
一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用
本专利技术属于生物催化
，具体涉及一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用。
技术介绍
全细胞催化避免了纯酶的分离和纯化过程，从而可降低生产成本，并且细胞与产物容易分离从而实现酶的回收和再利用(RenewableEnergy,2016,85:1002-1010)。另外，被全细胞保护的胞内酶比游离酶更稳定(AlgalResearch,2017,28:16-23)。然而，由于全细胞催化剂中存在细胞壁/膜，底物与酶的活性位点的结合受到限制，产品难以及时流出细胞外，导致产物抑制和目标产物的收率降低。因此，有必要采取措施增加酶与底物之间的接触，从而提高全细胞催化的效率。目前，应用最广泛的方法有以下两种：1)利用细胞表面展示技术将目的蛋白基因锚定在细胞表面，酶与底物可以直接在细胞表面结合(AppliedBiochemistryandBiotechnology,2017,1:1-23)，进行催化过程；2)通过物理、化学以及分子生物学方法提高细胞渗透性来增加细胞内外的传质效率以增强酶与底物的接触(JournalofBiotechnology,2017,248:9-14)。尽管第一种方法可以在一定程度上增加酶与底物的接触，但需要考虑被展示目的蛋白的分子大小以及目标蛋白的筛选和其他复杂的分子生物学过程。因此更多学者倾向于第二种方法。提高细胞通透性，允许小分子和某些大分子自由地通过细胞而不破坏细胞生物体并且可以避免复杂的操作过程。离子液体和低共熔溶剂是近年来受到广泛关注催化过程的促进剂。离子液体具有环境友好，具有低饱和蒸气压，不易燃性，疏水性和良好的热力学稳定性(CarbohydratePolymers,2015,118:150-155)等特性。有研究以离子液体[EMIM][BF4]作为溶剂，通过脂肪酶合成吲哚四氢色烯，并且获得了较高的得率(77-98％)(Catalysts,2017,7:185-195)，自低共熔溶剂被发现以来，已被用于分离过程、功能材料、化学反应、电化学等领域。由于其低成本，低毒性和可生物降解的特性而表现出良好的应用前景，离子液体与低共熔溶剂具有非常相似的物理化学性质，使其成为原子利用率接近100％的绿色溶剂。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术针对全细胞催化剂细胞内外传质及其改善方法的相关问题，以重组大肠杆菌细胞为研究对象，一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用，能够增大细胞通透性，增强细胞内外传质，利用胞内糖苷酶催化芦丁合成珍稀天然产物的方法。技术方案：一种增大通透性的全细胞催化剂的制备方法，步骤为：利用磷酸缓冲液重悬发酵培养的表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体，得到全细胞催化剂，再加入离子液体或低共熔溶剂置于水浴摇床进行反应；离子液体或低共熔溶剂占总体积的1％～20％，反应温度30～60℃，转速180rpm；处理时间0.5～3h；处理后离心并收集菌体，利用磷酸缓冲液清洗掉残留离子液体/低共熔溶剂，既得通透性增大的全细胞催化剂。上述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐；上述低共熔溶剂为质量比1:2的氯化胆碱-尿素、质量比1:2的氯化胆碱-甘油、质量比1:2的氯化胆碱-乙酰胺、质量比1:2的氯化胆碱-乙二醇、质量比1:1的氯化胆碱-丙二酸。上述大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)。上述制备方法制得的全细胞催化剂。上述全细胞催化剂在生物转化芦丁中的应用。应用的具体步骤为：将全细胞催化剂与芦丁混合，进行芦丁生物转化，反应温度为反应温度为30～60℃；反应pH为pH4.5～7.0；底物芦丁浓度为0.02～2g/L；反应时间为0.5～6h。有益效果：本专利技术采用离子液体/低共熔溶剂改善全细胞催化剂的通透性，提高胞内酶与底物接触几率。由于细胞壁/膜的存在严重影响了增强细胞内外传质效率，使酶与底物的结合严重受阻，同时底物无法及时流出细胞外，极易造成产物抑制，采用离子液体/低共熔溶剂增大细胞的通透性，有助于解决上述问题，从而扩大全细胞催化剂的应用范围。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本专利技术实施例中制备表达鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌细胞方法为：接种于含有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中(3～5mL)，37℃振荡培养生长至指数期。按照2％的接菌量转接到含有氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基中(500mL)，22℃恒温振荡培养至OD600达到0.6～0.8时，添加400μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，将温度降到17℃进行低温诱导表达16～20h。诱导表达结束的菌液在4℃下8000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.2～7.4PBS缓冲液清洗菌体两次既得全细胞催化剂。本专利技术实施例中使用检测芦丁和异槲皮苷定性定量的测定方法为高效液相色谱法，条件为：H&EPumpP3000A恒流泵，UV-VIS检测器，色谱柱型号AlltimaC18，长度为25mm，内径为5μm，采用HPLC-UV分离和测定芦丁和异槲皮苷，柱温维持在30℃。流动相为乙腈：(0.02％)磷酸(体积比20：80)，流速1.0ml·min-1，检测波长360nm。进样量为20μL。进样前，样品均通过0.45μm过滤器过滤。其中，芦丁转化率和异槲皮苷得率计算方法为:实施例1本实施例说明以低共熔溶剂氯化胆碱-尿素处理大肠杆菌全细胞制备催化剂催的过程。表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体细胞与绿化胆碱-尿素质量比1:20，所述氯化胆碱:尿素的质量比为1:2，溶于10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝5.0)，将混合物置于水浴摇床，30℃，180rpm处理0.5h。结束后于高速冷冻离心机6000rpm，4℃下离心10min，收集菌体。用磷酸缓冲液(pH＝7.4)洗涤2次后再次收集菌体，制备全细胞催化剂。实施例2本实施例说明以低共熔溶剂氯化胆碱-尿素处理大肠杆菌全细胞制备催化剂催的过程。表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体细胞与绿化胆碱-尿素质量比1:4，所述氯化胆碱:尿素的质量比为1:2，溶于10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝5.0)，将混合物置于水浴摇床，60℃，180rpm处理3h。结束后于高速冷冻离心机6000rpm，4℃下离心10min，收集菌体。用磷酸缓冲液(pH＝7.4)洗涤2次后再次收集菌体，制备全细胞催化剂。实施例3本实施例说明以低共熔溶剂氯化胆碱-尿素处理大肠杆菌全细胞制备催化剂催的过程。表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体细胞与绿化胆碱-尿素质量比1:10，所述氯化胆碱:尿素的质量比为1:2，溶于10mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝5.0)，将混合物置于水浴摇床，45℃，180rpm处理1.5h。结束后于高速冷冻离心机6000rpm，4℃下离心10min，收集菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增大通透性的全细胞催化剂的制备方法，其特征在于步骤为：利用磷酸缓冲液重悬发酵培养的表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体，得到全细胞催化剂，再加入离子液体或低共熔溶剂置于水浴摇床进行反应；离子液体或低共熔溶剂占总体积的1%~20%，反应温度30~60℃，转速180 rpm；处理时间0.5~3 h；处理后离心并收集菌体，利用磷酸缓冲液清洗掉残留离子液体/低共熔溶剂，既得通透性增大的全细胞催化剂。

【技术特征摘要】
2018.06.15 CN 201810622512X1.一种增大通透性的全细胞催化剂的制备方法，其特征在于步骤为：利用磷酸缓冲液重悬发酵培养的表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体，得到全细胞催化剂，再加入离子液体或低共熔溶剂置于水浴摇床进行反应；离子液体或低共熔溶剂占总体积的1%~20%，反应温度30~60℃，转速180rpm；处理时间0.5~3h；处理后离心并收集菌体，利用磷酸缓冲液清洗掉残留离子液体/低共熔溶剂，既得通透性增大的全细胞催化剂。2.根据权利要求1所述一种增大通透性的全细胞催化剂的制备方法，其特征在于所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王俊，张凡，王华，朱长通，彭强民，汪波，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32