一种标记存活的革兰氏阳性细菌及其细胞壁的方法技术

本发明专利技术涉及一种对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁进行标记的方法。所述方法通过生物正交反应，利用细菌自身的代谢途径将叠氮修饰的全乙酰化N‑乙酰葡糖胺‑1‑磷酸掺入细胞壁肽聚糖中，随后通过点击化学反应，将可检测标记物偶联至肽聚糖，从而实现对细菌肽聚糖的标记。所述方法具有普适性，可用于快速、便捷地标记革兰氏阳性细菌。

A Method for Marking Survival Gram-positive Bacteria and Their Cell Wall

The present invention relates to a method for marking the cell wall of surviving Gram-positive bacteria. The method incorporates azido-modified N acetylglucamine 1 phosphoric acid into cell wall peptidoglycan by bio-orthogonal reaction and bacterial metabolic pathway, and then couples detectable markers to peptidoglycan by clicking on chemical reaction, thereby realizing the labeling of bacterial peptidoglycan. The method is universal and can be used to label Gram-positive bacteria quickly and conveniently.

【技术实现步骤摘要】
一种标记存活的革兰氏阳性细菌及其细胞壁的方法
本专利技术涉及一种通过生物正交反应，利用细胞壁的生物合成途径来标记存活的革兰氏阳性细菌的方法。
技术介绍
目前已知多种细菌的细胞表面标记技术。例如，可使用表达能够与细菌表面蛋白结合的目标蛋白的基因工程方法。然而，此类细胞表面工程学方法仅适用于标记蛋白和多肽类。与基因操作方法相比，基于代谢路径的化学方法可通过添加代谢类似物小分子，利用细胞自身的代谢通路将非天然化学标签共价连接至不同的非天然表位。革兰氏阳性细菌细胞壁的典型组成成份之一为肽聚糖。肽聚糖是一种网络状杂多糖，其骨架由肽和聚糖两部分组成，其中的肽包括四肽尾和肽间桥两部分，而聚糖是由N-乙酰葡糖胺(G)和N-乙酰胞壁酸(M)两种单糖通过β-1,4糖苷键交替相连成的长链。真核细胞中不含肽聚糖，因此，肽聚糖是很好的抑制或标记细菌的靶标。然而目前，对肽聚糖在细菌中的生物合成途径知之甚少。对于肽聚糖的研究也仅限于发现其作为抑制剂靶标的潜在新用途。近十年来，对肽聚糖的合成进行追踪或编辑的研究取得了很大的进展。最近报道的肽聚糖的成像方法包括利用荧光标记的凝聚素(或抗体)、利用能够作用于细胞壁的带有荧光标签的抗生素、基于对游离的硫醇进行检测或放射性物质示踪的代谢标记的策略、利用荧光底物的酶法等。尽管这些技术已经用于揭示细菌细胞壁肽聚糖代谢的动力学过程，然而，这些技术操作过于繁杂而分辨率较低，且仅适用于特定的细菌种属，在应用的普适性方面存在很大的局限性。在上述技术中，荧光标记的抗体技术因其操作简单、物质在短时间内溶解性较高而最为广泛应用。然而，荧光标记的抗体可抑制细菌的活性，难以用其标记生长初期的革兰氏阳性菌。目前仍存在对于不干扰细菌生长的肽聚糖标记方法的需求。生物正交反应是指具有如下特征的化学反应：在生理条件下进行，不干扰同时发生的其它生化反应或各种生物内源过程，且不会对生物体及生物内源分子造成损伤。目前最常用的生物正交反应基团对包括能够发生点击化学(ClickChemistry)反应的叠氮基-炔基以及叠氮基-三芳基膦。其中，叠氮基与三芳基膦发生的施陶丁格反应(StaudingerLigation)或与炔基发生的环加成反应均能将与该生物正交反应基团对中的一个成员相连的糖偶联至与该生物正交反应基团对中的另一成员相连的可检测标记物，实现将可检测标记物修饰至糖的目的。其中，叠氮基团与高张力炔烃的环加成反应(Strain-promotedazide-alkynecycloaddition，SPAAC)因其不需要添加催化剂而成为研究和应用热点。自2001年点击化学反应被提出以来，该反应已被广泛应用于表面修饰、树枝状化合物和功能聚合物的生成、细胞标记、生物医药合成、核酸或碳纳米管的修饰等。CN104039977B提出了一种利用叠氮基-炔基生物正交反应标记革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖的方法。然而，目前还未报道对革兰氏阳性细菌的细胞壁进行标记的方法。
技术实现思路
本专利技术旨在利用革兰氏阳性细菌自身的代谢路径，将代谢类似物小分子添加至细胞壁，并基于生物正交反应来开发对存活的革兰氏阳性细菌及其细胞壁进行标记的方法。一方面，本专利技术的目的在于提供一种对存活的革兰氏阳性细菌进行标记的方法，所述方法包括如下步骤：(i)在革兰氏阳性细菌培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，将革兰氏阳性细菌接种入所述培养基中并对所述革兰氏阳性细菌进行培养，得到细菌培养物；(ii)收集步骤(i)得到的所述细菌培养物，通过处理得到所述细菌培养物的沉淀物；(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀物中的细菌进行固定；(iv)向步骤(iii)的经固定的细菌中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细菌内的肽聚糖；(v)对所述可检测标记物进行检测。另一方面，本专利技术提供了叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸用于对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁进行标记的用途，其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的叠氮基与连接至可检测标记物的炔基或三芳基膦的生物正交反应来实现对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁的标记。又一方面，本专利技术提供了叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸用于在包含细菌的样品中特异性地标记存活的革兰氏阳性细菌的用途，其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的叠氮基与连接至可检测标记物的炔基或三芳基膦的生物正交反应来实现对存活的革兰氏阳性细菌的细胞壁的标记。再一方面，本专利技术提供了一种用于检测存活的革兰氏阳性细菌的试剂盒，其中，所述试剂盒包含叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸以及连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物。附图说明图1为根据实施例2，实验组肽聚糖的HPLC图谱。图2为根据实施例2，实验组中6-叠氮基甲基-N-乙酰葡糖胺的LC-MS图谱。图3为根据实施例2，实验组中N-乙酰葡糖胺的LC-MS图谱。图4为根据实施例2，对照组肽聚糖的HPLC图谱。图5为根据实施例2，对照组单糖(N-乙酰葡糖胺)的LC-MS图谱。图6为根据实施例3，实验组BCG菌细胞壁标记的荧光结果图(放大倍数100倍)。其中，1为明场，2为FITC通道，3为TXRED通道，4为1、2、3的叠加图。图7为图6中的单个细菌的放大图。其中，1为明场，2为FITC通道，3为TXRED通道，4为1、2、3的叠加图。图8为根据实施例3，对照组BCG菌细胞壁标记的荧光结果图(放大倍数100倍)。其中，1为明场，2为FITC通道，3为TXRED通道，4为1、2、3的叠加图。具体实施方式本专利技术通过革兰氏阳性细菌中的肽聚糖的生物代谢途径将叠氮修饰的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸引入革兰氏阳性细菌细胞壁的肽聚糖中，利用生物正交反应在温和条件下引入探针分子(可检测标记物)，从而实现对存活的革兰氏阳性细菌细胞壁的标记。相比于使用遗传工程的其它标记方法，本方法操作更为简单。由于全部革兰氏阳性细菌细胞壁的骨架均为肽聚糖，且N-乙酰葡糖胺-1-磷酸(GlcNAc-1P)为肽聚糖的合成前体，该方法对革兰氏阳性细菌具有普适性。此外，本专利技术所使用的非天然N-乙酰葡糖胺-1-磷酸对细菌的生长和活性几乎没有影响，有助于实现对革兰氏阳性细菌活菌的快速、便捷的标记。本专利技术所使用的术语“革兰氏阳性细菌”具有本领域公知的含义，即，由于其细胞壁主要成分为肽聚糖而能够通过革兰氏染色染成深蓝色或紫色的细菌。能够作为本专利技术方法检测对象的革兰氏阳性细菌为符合革兰氏阳性细菌分类定义的全部细菌，包括但不限于：分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、梭菌属(Clostridium)、李斯特氏菌属(Listeria)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)等。优选地，所述革兰氏阳性细菌选自于：结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、白喉杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对存活的革兰氏阳性细菌进行标记的方法，所述方法包括如下步骤：(i)在革兰氏阳性细菌培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N‑乙酰葡糖胺‑1‑磷酸，将革兰氏阳性细菌接种入所述培养基中并对所述革兰氏阳性细菌进行培养，得到细菌培养物；(ii)收集步骤(i)得到的所述细菌培养物，通过处理得到所述细菌培养物的沉淀物；(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀物中的细菌进行固定；(iv)向步骤(iii)的经固定的细菌中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细菌内的肽聚糖；(v)对所述可检测标记物进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种对存活的革兰氏阳性细菌进行标记的方法，所述方法包括如下步骤：(i)在革兰氏阳性细菌培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸，将革兰氏阳性细菌接种入所述培养基中并对所述革兰氏阳性细菌进行培养，得到细菌培养物；(ii)收集步骤(i)得到的所述细菌培养物，通过处理得到所述细菌培养物的沉淀物；(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀物中的细菌进行固定；(iv)向步骤(iii)的经固定的细菌中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细菌内的肽聚糖；(v)对所述可检测标记物进行检测。2.叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸用于对存活的革兰氏阳性细菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学兵，丁超，孙欢，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11