与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供了与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记及其应用。本发明专利技术提供的SNP分子标记通过KASP技术采用三条引物检测得到，所述三条引物分别为：两条末端碱基不同的等位基因正向引物(SEQ ID NO.4+NO.1，SEQ ID NO.5+NO.2)和一条反向引物(SEQ ID NO.3)，其中SEQ ID NO.4、5分别为两条正向引物的接头序列。本发明专利技术的SNP标记有助于黄瓜表皮毛硬度相关基因的克隆及黄瓜分子标记辅助选择育种体系的建立，且此标记与果刺硬度性状共分离，可以简便、快速、高通量地应用于黄瓜果刺硬度差异类型的筛选，对提高黄瓜育种选择效率具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记及其应用
本专利技术属于植物分子遗传育种领域，具体涉及与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的的SNP分子标记及其应用。
技术介绍
黄瓜(CucumissativusL.)是葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)一年蔓生的草本植物，是我国主栽蔬菜作物之一。黄瓜作为重要的果菜类蔬菜，果实品质一直是黄瓜育种研究的重点。果实的品质分为感观品质、风味品质和营养品质，目前已鉴定的品质基因多为感观品质基因，包括瓜色、瓜长、果刺多少、果刺颜色、果瘤大小、果色均匀度、光泽度、果棱、果实表面黄色条纹等。其中外观品质对黄瓜的商品性具有重要影响。果刺是附着于果实表面的一种特化的表皮毛，果刺的软硬是影响黄瓜果实商品性状的重要指标之一。黄瓜果刺硬度是指黄瓜果刺质地软硬(触感扎手与否)的程度。现在市场上多数的有刺黄瓜为硬刺品种，本实验室在田间发现一种软刺品种。研究黄瓜果刺硬度的遗传及分子标记，对于选育符合市场需求的黄瓜新品种具有重要意义。果刺的软硬是影响黄瓜果实商品性状的重要指标之一。黄瓜果刺硬度是指黄瓜果刺质地软硬的程度。据申请人调查，相对于硬刺型而言，软果刺易脱落及造成果实失水，影响果实的耐藏性。且生产管理过程中，黄瓜植株颈部易于折断，特别是遇田间吊蔓等田间生产管理不及时，易于因生长点折断等植株损伤而造成产量降低等经济缺失。因此，分离黄瓜果刺硬度调控基因，并开展其生物学功能研究对进一步探讨黄瓜果刺发育机制及分子育种具有重要理论及实践意义。然而，截至目前有关果刺硬度的基因及其分子标记开发的研究尚未见报道。BSA，即混池分组分析法(Bulksegregantanalysis)，是最常用的标记筛选方法，该方法在一对具有目的基因表型差异的亲本所构建的分离群体中，根据目标性状的表型，将分离群体(如F2代)表型极端的子代分别混合成两个样本池，形成两个相对性状的“基因池”(Genepool)，然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，在两池间表现出多态性的分子标记与目的基因座位相连锁，再利用分离群体进一步检测所得分子标记与目的基因的连锁程度，从而确定其在已知分子图谱或染色体上的位置。由于构建基因池使用了特定的分离群体，且在分组时仅对目的基因表型进行选择，这样保证了其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上应主要在目的基因区段存在差异，排除了环境及人为因素的影响，使研究结果更为准确可靠。单核苷酸多态性(SNPs)，广泛存在于真核生物中，是指染色体基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，是继限制性酶切片断长度多态性、可变数量重复序列和微卫星多态性之后的新一代多态性遗传标记，此标记应用领域广泛，如关联分析，遗传多样性分析等等，在分子标记辅助选择育种中起着至关重要的作用。KASP技术已经成为国际上SNP分析的主流方法之一，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAlleleSpecificPCR)的缩写，可以对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(InsertionsandDeletions，插入和缺失)。KASP技术可以应用于任何规模的检测SNP标记基因分型基因工程，缩短标记的验证时间，减少标记的检测成本，是当前应用于植物分子标记定位和大群体扫描的重要方式。KASP在大规模标记验证工作的应用中也具有明显优势，当通过一系列手段得到某个性状相关联的候选分子标记后(SNPs&Indels)，将对更大的群体进行实验验证。一般验证工作会选择上千份样本进行，但对于如此之大的群体进行多个位点的验证，将会带来非常大的工作量，相当占用人力物力。基于PCR原理的KASP技术却可对此难题迎刃而解，使得几千样本，上百位点的基因分析工作快速完成。不仅如此，KASP平台还配套有DNA自动提取功能，可以实现一站式完成超大样本量的分子标记验证工作。KASP基于自己独特的ARMPCR原理，可以让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了KASP的试剂成本，既有金标准的准确，又降低了使用成本，所以在医学、农学检测方面KASP都具有非常好的应用前景。植物品种鉴定与种子质量控制在育种工作中是非常重要的，播种前通过对种子品种的鉴定可以有效避免育种工作中出现不必要的风险；通过种子质量控制可以保证种子的遗传纯度，降低种植成本。传统方式对品种进行鉴定或对种子质量进行评估的成本较高，鉴定周期较长，而KASP技术则可以有效避免这两个缺点，使得育种成本大大降低，鉴定周期也明显缩短，是品种鉴定与种子质量控制方面的一项优选技术。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种与黄瓜表皮毛及果刺硬度基因Hard共分离的分子标记。本专利技术另一目的是提供一种利用本专利技术的SNP分子标记快速、简便鉴别黄瓜表皮毛及果刺硬度性状的方法。本专利技术利用BSA法，高效快速的找到与性状相关的分子标记，以便分子标记辅助育种体系的建立以及快速、高通量地应用于育种实践。本专利技术涉及了一个与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记，命名为CosegregatedSNP-H，该SNP分子标记位于黄瓜1号染色体6246611bp的位置处，其多态性为T/C,该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQIDNO.6所示，该序列第25位碱基的多态性为T/C。CCAGAATGGGCGTCTCTGATACTG[T/C]AAGTAGCTCGAATTCGACTGATTTTTATCTTGTTTGCTGCTTGGTGTTATATTCTTGTTTTGGCTGTCCCTT(SEQIDNO.6)。硬刺型为T，软刺型为C。进一步地，本专利技术的SNP分子标记，其由以下任一特异性引物对扩增获得：正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’(SEQIDNO.4+SEQIDNO.1)，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’(SEQIDNO.3)；或正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’(SEQIDNO.5+SEQIDNO.2)，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’(SEQIDNO.3)。本专利技术提供了用于检测上述SNP分子标记的特异性引物对，其为：正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’(SEQIDNO.4+SEQIDNO.1)，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’(SEQIDNO.3)；或正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’(SEQIDNO.5+SEQIDNO.2)，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记，该标记位于黄瓜1号染色体6246611bp的位置处，其多态性为T/C,该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.与黄瓜果刺硬度基因Hard共分离的SNP分子标记，该标记位于黄瓜1号染色体6246611bp的位置处，其多态性为T/C,该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQIDNO.6所示。2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，其由以下任一特异性引物对扩增获得：正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’；或正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’。3.用于检测权利要求1或2所述SNP分子标记的特异性引物对，其特征在于，其为：正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGT-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’；或正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGAATGGGCGTCTCTGATACTGC-3’，其中第1-21碱基是检测接头序列，反向引物：5’-GCAGCAAACAAGATAAAAATCAGTCGA-3’。4.一种用于检测黄...

【专利技术属性】
技术研发人员：任华中，薛舒丹，刘兴旺，蔡艳玲，董明明，张亚琦，刘慧玲，赵彬煜，王亭，蹇晨，徐硕，祁文竹，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11