一种中性蛋白酶的提纯方法技术

本发明专利技术公开了一种中性蛋白酶的提纯方法,包括如下步骤：1)采用枯草芽孢杆菌AS1.398菌种发酵，得到中性蛋白酶发酵液；往发酵液中添加絮凝剂；2)板框过滤：将中性蛋白酶发酵液进行板框过滤收集滤液；3)离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心；4)粗滤：将收集的离心液进行粗滤；5)精滤：采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩；6)添加酶活保护剂：添加海藻糖和β‑环状精；7)沉淀:添加食用乙醇，收集中性蛋白酶沉淀部分；8)真空干燥：真空干燥，即可得到中性蛋白酶。本发明专利技术能有效的解决中性蛋白酶活损失问题，酶活收率明显提高。

【技术实现步骤摘要】
一种中性蛋白酶的提纯方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种中性蛋白酶的提纯方法。
技术介绍
蛋白酶是生物体内的一类酵素(酶)，它们能够分解蛋白质。分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称蛋白酶抑制剂。许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。蛋白酶广泛存在于动物内遭、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗，还可用于将组织处理成为单个细胞，进行细胞组织培养。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的眎和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。酶的应用已有千年以上的历史，虽然中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，但是广泛应用还是最近几十年的事。随着科学技术的发展，随着酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造等酶技术的发展，中性蛋白酶的应用范围也不断扩大。自上世纪以来，世界各国科研工作者一直都致力于中性蛋白酶产生菌的筛选、酶提取、纯化以及酶学性质的研究和应用研究工作，取得了一定的成绩。对于中性蛋白酶的研究主要集中于以下几个方面：一是继续研究发现新的蛋白酶品种。二是对现有蛋白酶进行修饰、改性，延长和强化其功能，期望在降低应用成本的同时，减少酶本身的一些缺陷对其应用的限制。三是通过生物技术手段提高酶产量，降低酶生产成本。现代生物技术不仅发达而且发展很快，技术应用的可选择范围也很广，例如物理或化学诱变技术、细胞质融合技术、转基因技术以及克隆技术等等。四是提取和纯化技术，可以应用盐析、层析和凝胶过滤等技术，在提高纯化倍数提高的同时提高中性蛋白酶的提取率。目前，工业上采用枯草芽孢杆菌AS1.398生产中性蛋白酶已有多年的历史,是一类被广泛应用于工业生产的酶类,在洗涤剂、制革、丝绸、食品加工等多种行业上有着广泛的用途。目前我国发酵生产中性蛋白酶工艺主要是发酵液直接喷雾干燥或盐析沉淀后再烘干，此类产品由于生产工艺过程的局限性，酶活在高温环境损失较大，酶活收率低，产品杂质多，微生物等卫生指标不符合食品行业要求，应用范围受限制，因此对发酵液中性蛋白酶的分离、提纯很有必要。生物技术是当今迅速发展的高新
，是21世纪最具有发展潜力的新兴产业，涵盖了基因工程、细胞工程、酶工程和生物化学工程等。目前，生物技术已被广泛用于食品、医药、农业、化工环保等部门。随着科学技术的进步、经济的发展和人民生活水平的提高，人们对食品的组成成分、营养价值和感官要求也越来越高，食品工业不再是传统农业食品的概念，工业食品将在人们日常生活中占据重要的地位。近30年来，细胞生物穴和分子生物学等领域在理论和方法上的突飞猛进、推动、促进了生物技术从传统技术转化为高新技术，为食品工业的技术进步注入了新的活力。胶原是动物体内含量最多，分布最广的一类蛋白质，胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域有着广泛的应用。如中国传统的保健品阿胶，是驴皮为马科动物驴的干燥皮或鲜皮为原料制备而成。驴皮原料是极其复杂的物质，基本上是由蛋白质和非蛋白质两大组分，其中，蛋白质占鲜皮的30％-35％，生皮中的蛋白质种类很多，皮料蛋白质为纤维蛋白，非纤维蛋白等。纤维蛋白由胶原、角朊、弹性角朊等，胶原约占全部蛋白质总量的88％。驴皮中富含驴皮胶，具有滋阴补血、安胎的功效，驴皮胶含有多种蛋白质、氨基酸、钙等，能改善血钙平衡，促进红细胞的生成。驴皮胶还能用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌萎无力，心烦不眠等。目前，驴皮的应用主要是作为熬制阿胶的主要原料。驴皮的质量是影响阿胶质量的最重要的因素，驴皮分为三层，表面为角质层，里层为脂肪层，中层是胶原蛋白层。目前对驴皮的加工方法采用水做溶媒，长时间泡皮后用刮毛刀刮出驴皮的毛，操作周期长，工艺落后，劳动强度大。现代工艺一般采用过滤去毛、酶法脱毛、灰法脱毛、盐碱脱毛、氧化脱毛等，然而这些工艺会严重影响驴皮的质量。目前，驴皮的保存方法一般采用盐腌法或干燥法进行前处理。干燥法一般是指自然晾晒干燥，将皮张平铺在地方进行晾晒干燥。该法干燥时间长，生产效率低下，而且人工投入大，工人劳动强度大，劳动环境差，皮张在干燥过程中还会产生自然收缩、粘结、易造成局部干燥不透等现象。盐腌法保存驴皮一般指的是池法撒盐法和平地撒盐法两种方法。在两种方法中，池法撒盐腌制法保存法使用的最普遍。中国专利201710302556.X公开了一种驴皮加工工艺，经过泡皮、碱膨胀、滚盐、酶解、灭酶、焯皮、化皮等过程，加工过程高便捷，脱毛效果好，并且减少了对环境的污染。中国专利201410222689.2公开了一种中药阿胶原料药材驴皮的前处理方法，包括：1)鼓滚盐水腌制；2)沥水。该专利技术利用鼓滚盐水取代了传统的撒盐叠皮步骤，腌制的过程同时带有机械作用，腌制效率高，高浓度的食盐水对皮张的灭菌作用，有效减少皮张的腐败。中国专利20101076321.9公开了一种驴皮胶原的制备方法，以鲜驴皮为原料，通过脱毛、脱脂、碎皮、碱液浸泡、低温酶解、纯化，改性等步骤，得到改性的驴皮胶原产品。通过该方法得到的驴皮胶原产品。上述现有技术中的驴皮是作为阿胶的制备原料，目前市场上销售的驴皮类产品也多作为阿胶类的保健食品和药物类产品出售，而驴皮作为一种日常食用的产品却没有得到普及，此外，驴皮具有腥臭味，口感涩硬，不易咀嚼，极大地限制了驴皮的食用性。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种中性蛋白酶的提纯方法，能有效的解决中性蛋白酶活损失问题，酶活收率明显提高。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种中性蛋白酶的提纯方法,其特征在于包括如下步骤：1)采用枯草芽孢杆菌AS1.398菌种进行发酵，得到中性蛋白酶发酵液；然后往发酵液中添加絮凝剂，搅拌均匀，静置30分钟，使杂质与絮凝剂结合成团状；有利于过滤；2)板框过滤：将絮凝反应完成后的中性蛋白酶发酵液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，收集滤液；3)离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心，转速为：10000rpm,进料流速为80L/h，收集离心液；4)粗滤：将收集的离心液进行粗滤，采用聚偏氟乙烯滤膜进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中性蛋白酶的提纯方法,其特征在于：包括如下步骤：1)采用枯草芽孢杆菌AS1.398菌种进行发酵，得到中性蛋白酶发酵液；然后往发酵液中添加絮凝剂，搅拌均匀，静置30分钟，使杂质与絮凝剂结合成团状；2)板框过滤：将絮凝反应完成后的中性蛋白酶发酵液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6‑0.8MPa，收集滤液；3)离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心，转速为：10000rpm,进料流速为80L/h，收集离心液；4)粗滤：将收集的离心液进行粗滤，采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，聚偏氟乙烯滤膜的孔径为0.22um和0.1um，操作压力0.1MPa；要求料液经过两次膜过滤，膜孔径分别为0.22um和0.1um，除去杂质和细菌；5)精滤：将经过粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩，聚砜超滤膜的截留分子量为10K，操作压力0.1MPa；得到中性蛋白酶浓缩液；6)添加酶活保护剂：往步骤5)得到的中性蛋白酶浓缩液中添加酶活保护剂，搅拌均匀；其中，所述酶活保护剂包括海藻糖和β‑环状糊精，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8‑1.2％，β‑环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5％；7)沉淀:往经过步骤6)处理后的中性蛋白酶浓缩液中添加食用乙醇，边添加边缓慢搅拌，使得中性蛋白酶分子结晶沉淀出来，收集絮状的中性蛋白酶沉淀部分；8)真空干燥：将步骤7)收集得到的絮状的中性蛋白酶沉淀部分进行真空干燥，即可得到中性蛋白酶。...

【技术特征摘要】
2018.05.08 CN 20181043169041.一种中性蛋白酶的提纯方法,其特征在于：包括如下步骤：1)采用枯草芽孢杆菌AS1.398菌种进行发酵，得到中性蛋白酶发酵液；然后往发酵液中添加絮凝剂，搅拌均匀，静置30分钟，使杂质与絮凝剂结合成团状；2)板框过滤：将絮凝反应完成后的中性蛋白酶发酵液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，收集滤液；3)离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心，转速为：10000rpm,进料流速为80L/h，收集离心液；4)粗滤：将收集的离心液进行粗滤，采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，聚偏氟乙烯滤膜的孔径为0.22um和0.1um，操作压力0.1MPa；要求料液经过两次膜过滤，膜孔径分别为0.22um和0.1um，除去杂质和细菌；5)精滤：将经过粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩，聚砜超滤膜的截留分子量为10K，操作压力0.1MPa；得到中性蛋白酶浓缩液；6)添加酶活保护剂：往步骤5)得到的中性蛋白酶浓缩液中添加酶活保护剂，搅拌均匀；其中，所述酶活保护剂包括海藻糖和β-环状糊精，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8-1.2％，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5％；7)沉淀:往经过步骤6)处理后的中性蛋白酶浓缩液中添加食用乙醇，边添加边缓慢搅拌，使得中性蛋白酶分子结晶沉淀出来，收集絮状的中性蛋白酶沉淀部分；8)真空干燥：将步骤7)收集得到的絮状的中性蛋白酶沉淀部分进行真空干燥，即可得到中性蛋白酶。2.如权利要求1所述的中性蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤1)中，所述絮凝剂是阴离子聚丙烯酰胺；添加絮凝剂时，需先将絮凝剂按重量比为1:1000的比例溶解于水中，得到预溶絮凝液，然后将预溶絮凝液按重量比为1:100的比例添加到中性蛋白酶发酵液中，缓慢搅拌10分钟。3.如权利要求1所述的中性蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤6)中，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8％，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5％。4.一种膳食用驴皮的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)原料预处理：将原料驴皮上的污垢和残余碎肉割除干净，刮尽皮下剩余油脂，然后将修整好的驴皮加入清水中冲洗，直至清水无色，得到预处理后的驴皮；(2)脱毛：将步骤(1)中预处理后的驴皮浸泡到脱毛液中，加热至30-35℃，浸泡20-40分钟后，用高压水枪喷洗驴皮表面，进行脱毛处理，得到脱毛驴皮；(3)软化：将软化液倒入塑料桶中，将步骤(2)中得到的脱毛驴皮置于1-3℃的软化液中进行第一次软化，软化8小时后将驴皮捞出，将捞出后的驴皮在-20--10℃下冷冻4-6小时后取出，然后置于1-3℃的软化液中进行第二次软化，软化8小时后将驴皮捞出，将捞出后的驴皮在-10--5℃下冷冻4-6小时后取出，然后置于1-3℃的软化液中进行第三次软化，软化8小时后将其捞出，得到软化后的驴皮；(4)漂洗：将步骤(3)中得到的软化后的驴皮放入清水中漂洗，取一块漂洗后的驴皮切断，用pH试纸测量驴皮断面处的pH值，当驴皮断面处的pH值为中性，漂洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪智杰，
申请(专利权)人：北京开元鲁采餐饮管理有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11