一种脱卤过氧化物酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于人工金属酶领域，公开了一种高效的脱卤过氧化物酶及其制备方法与应用。本发明专利技术所述脱卤过氧化物酶是利用运输氧功能的肌红蛋白作为蛋白质分子设计骨架，将肌红蛋白血红素活性中心附近43位突变为酪氨酸，同时将64位的组氨酸突变成酸性的天冬氨酸，从而构建具有催化功能的双点突变体蛋白F43Y/H64D Mb，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术所述人工脱卤过氧化物酶，能够在低H2O2浓度下数秒内催化卤代酚氧化成低毒的醌类产物，达到脱卤效果，在催化转化数相近的情况下，极大地提高了双突变体蛋白对卤代酚的亲和力，其催化效率比单点突变体蛋白明显提高，从而可以广泛应用到卤代酚类有机污染物的治理。

【技术实现步骤摘要】
一种脱卤过氧化物酶及其制备方法与应用
本专利技术属于人工金属酶领域，具体涉及一种脱卤过氧化物酶及其制备方法与应用，尤其是涉及一种基于肌红蛋白双点突变体的超高效人工脱卤过氧化物酶及其制备方法与应用。
技术介绍
随着现代工农业的迅速发展，卤代酚已经被广泛应用为农业化学品和生物杀伤剂。然而，卤代酚良好的水溶性也使得其对哺乳动物的肝脏和免疫系统均具有高生物学毒性。而且，卤代酚产生的自由基会对核酸碱基进行修饰，造成DNA损伤，已被视为一类潜在的致癌物。该类化合物被美国环境保护局(USEnvironmentalProtectionAgency,USEPA)列为优先控制的有机污染物(PriorityPollutants)。因此，对卤代酚类有机污染物进行有效治理具有重要意义，是环境生物无机化学领域的研究热点之一。其中，高效、专一及环保的生物修复(Bioremediation)方法引起了研究者的极大关注。脱卤过氧化物酶(Dehaloperoxidase,DHP，蛋白数据库编码1EW6)首先发现于生存在水环境中的面条虫Amphitriteornata中，该生物在被卤代酚污染的水环境中仍然具有生存能力，原因是其体内的DHP能够催化过氧化氢依赖性的卤代酚脱卤反应，生成低毒的醌类产物。DHP从被发现到现在已有20年之久，但由于其催化能力较低，使得其在生物降解方面的应用得到限制。蛋白质分子设计是进行金属蛋白(Metalloproteins)结构与功能优化的一种行之有效的方法，广泛用于血红素类蛋白的分子设计与构建。金属蛋白分子设计通常有两个途径：一种是“由上而下”(Top-down)途径，即研究天然金属蛋白或酶分子，通过改变或修饰蛋白已有的活性位点，对其结构与功能进行调控；另一种是“由下而上”(Bottom-up)途径，即研究人工金属蛋白或酶分子，通过基本结构单元的设计，重新构建出具有一定结构和催化活性的新型分子。在Top-down途径中，Dawson及其合作者通过在天然DHP的血红素附近86位引入酸性谷氨酸Glu(M86E突变)，形成推电子效应方法，使突变体M86EDHP蛋白的催化活性较天然DHP提高了～9.2倍(TON＝72.6min-1)；而在Bottom-up途径中，他们使用Mb作为模型蛋白分子，通过在血红素活性附近65位引入侧链较大异亮氨酸Ile(G65I突变)，使得活性中心远端His64与血红素中心Fe的距离更适合进行卤代酚的脱卤反应，G65IMb表现出的催化活性(TON＝129min-1)是天然DHP的16.3倍。X-射线晶体结构表明DHP同样为血红素蛋白(PDB编码1EW6)，且具有与其他球蛋白(如肌红蛋白(Mb)、过氧化物酶)相似的血红素活性位点。此外，Mb易于得到和表征的特质，经常被作为蛋白模板来设计具有其他功能的酶。在前期的研究报道中，设计了单点突变体F43YMb，其总的催化效率是野生型肌红蛋白的115倍，但是相对于相同条件下天然的DHP催化效率仅提高了9倍。因此对肌红蛋白进行脱卤过氧化物酶功能改造及优化，以进一步提高肌红蛋白的脱卤过氧化物酶活性，才能使蛋白酶分子在卤代酚污水处理中具有实际的应用前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷提供一种高效的脱卤过氧化物酶及其制备方法与应用。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术利用运输氧功能的肌红蛋白作为蛋白质分子设计骨架，选择多突变位点，将肌红蛋白血红素活性中心附近43位突变为酪氨酸，形成血红素-酪氨酸共价连接，同时将64位的组氨酸突变成酸性的天冬氨酸，且形成推电子效应方法，从而构建具有催化功能的人工金属酶，获得双点突变体蛋白F43Y/H64DMb，即一种新型的高效人工脱卤过氧化物酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了编码所述的脱色过氧化物酶的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本专利技术所述的脱卤过氧化物酶的核苷酸序列。本专利技术还提供了所述脱卤过氧化物酶的制备方法，运用定点突变技术，将肌红蛋白血红素活性中心附近43位突变为酪氨酸、64位突变为天冬氨酸，宿主细胞中表达后分离纯化。作为优选，本专利技术所述制备方法所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21系列菌株。在一个实施方案中，宿主细胞为BL21(DE3)菌株。作为优选，本专利技术所述制备方法所述分离纯化的方法依次为盐酸胍变性透析、离子交换和凝胶柱层析分离。本专利技术所述双点突变体蛋白F43Y/H64DMb人工脱卤过氧化物酶，能够在低H2O2浓度下数秒内催化卤代酚氧化成低毒的醌类产物，达到脱卤效果，在催化转化数相近的情况下，极大的提高了双突变体蛋白对卤代酚的亲和力，其催化效率比单点突变体蛋白F43YMb增加了170倍左右，从而可以广泛应用到卤代酚类有机污染物的治理。因此本专利技术还提供了所述脱卤过氧化物酶在处理污水中的卤代酚类有机污染物中的应用。本专利技术还提供了一种污水脱卤的方法，在H2O2存在下，向含有卤代酚的污水中加入权利要求1所述脱卤过氧化物酶进行反应。作为优选，所述污水脱卤的方法中，所述H2O2的浓度为1mM-20mM。在一些实施例中，所述H2O2的浓度为1mM。在一些实施例中，所述H2O2的浓度为20mM。在一些实施例中，所述H2O2的浓度为10mM。作为优选，所述污水脱卤的方法中，所述脱卤过氧化物酶的浓度为2μM-4μM。在一些实施例中，所述脱卤过氧化物酶的浓度为2μM。在一些实施例中，所述脱卤过氧化物酶的浓度为4μM。作为优选，所述污水脱卤的方法中，所述反应温度为25℃，所述反应pH值为7.0。作为优选，所述污水脱卤的方法中，所述卤代酚为2,4,6-三氯苯酚(TCP)。进一步作为优选，所述污水脱卤的方法中，所述卤代酚的浓度为≤0.1mM。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种高效的脱卤过氧化物酶及其制备方法与应用。本专利技术所述脱卤过氧化物酶是利用运输氧功能的肌红蛋白作为蛋白质分子设计骨架，选择多突变位点，将肌红蛋白血红素活性中心附近43位突变为酪氨酸，形成血红素-酪氨酸共价连接，同时将64位的组氨酸突变成酸性的天冬氨酸，且形成推电子效应方法，从而构建具有催化功能的人工金属酶，获得双点突变体蛋白F43Y/H64DMb，即一种新型的高效人工脱卤过氧化物酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述双点突变体蛋白F43Y/H64DMb人工脱卤过氧化物酶，能够在低H2O2浓度下数秒内催化卤代酚氧化成低毒的醌类产物，达到脱卤效果，在催化转化数相近的情况下，极大的提高了双突变体蛋白对卤代酚的亲和力，其催化效率比单点突变体蛋白F43YMb增加了160倍左右，是天然脱卤过氧化物酶DHP的1100多倍。此外，其反应条件的温和性，从而可以广泛应用到卤代酚类有机污染物的治理。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为F43Y/H64DMb的质谱图；图2为F43Y/H64DMb在H2O2存在下催化TCP氧化脱卤的紫外全谱变化图；图3为2μMF43Y/H64DMb中加入12μL10mMTCP母液，再与20mMH2O21:1(v:v)混合后的动力学曲线；图4为2μMH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脱卤过氧化物酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种脱卤过氧化物酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述的脱卤过氧化物酶的DNA分子。3.权利要求1所述脱卤过氧化物酶的制备方法，运用定点突变技术，将肌红蛋白血红素活性中心附近43位突变为酪氨酸、64位突变为天冬氨酸，宿主细胞中表达后分离纯化。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；所述分离纯化的方法依次为盐酸胍变性透析、离子交换和凝胶柱层析分离。5.一种污水脱卤的方法，在H2O2存在下...

【专利技术属性】
技术研发人员：林英武，尹露露，何博，高淑琴，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43