灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的蛋白质，命名为CiP‑G175F蛋白，如序列表的序列1所示。本发明专利技术还保护CiP‑G175F蛋白作为过氧化物酶的应用。本发明专利技术提供的过氧化物酶，发挥功能的单元为单一蛋白质，更加适用于工业化大规模生产。本发明专利技术提供的过氧化物酶，比活力高、底物亲和度高、底物谱广、性质稳定，可应用于清除废水中酚类物质、降解苯类物质、催化染料脱色、生物传感器、医药领域等多个领域，生产不受地域和气候限制。本发明专利技术具有重大的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
过氧化物酶是一系列能够氧化芳香胺类、酚类等化合物的氧化剂。过氧化物酶可以参与清除废水中的酚类物质，降解苯类物质，催化染料脱色，可用作清洁剂等，在纸浆造纸工业中极具应用潜力。过氧化物酶还可用于食品行业、煤炭行业、化工行业等多个领域。现有技术中，过氧化物酶经常用作酶联免疫吸附试验的标记酶，例如辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)。但是，HRP由至少12种不同催化活性的酶组成，且酶的比例随不同的生长周期进行改变。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用。本专利技术提供的蛋白质，命名为CiP-G175F蛋白，如序列表的序列1所示。编码CiP-G175F蛋白的基因(CiP-G175F基因)也属于本专利技术的保护范围。所述基因为如下(1)或(2)或(3)：(1)编码区序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码过氧化物酶的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码过氧化物酶的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有CiP-G175F基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌均属于本专利技术的保护范围。所述表达盒中，启动子具体可为AOX1启动子。所述表达盒中，终止子具体可为AOX1终止子。所述重组表达载体可为在表达载体中插入所述CiP-G175F基因得到的重组质粒。所述表达载体具体可为pPIC9K载体。所述重组菌是将所述CiP-G175F基因导入出发菌得到的。所述基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入出发菌。所述出发菌可为毕赤酵母，具体可为毕赤酵母X33。将毕赤酵母作为出发菌表达外源蛋白，具有生物量高、表达量高、生产成本低，产物稳定性好的优点。本专利技术还保护CiP-G175F蛋白作为过氧化物酶的应用。所述应用中，底物为ABTS或TMB。所述应用中，反应条件为pH4.5。所述应用中，反应体系为pH4.5、50mM醋酸缓冲溶液。本专利技术还保护CiP-G175F蛋白在制备具有过氧化物酶功能的产品中的应用。所述应用中，底物为ABTS或TMB。所述应用中，反应条件为pH4.5。所述应用中，反应体系为pH4.5、50mM醋酸缓冲溶液。本专利技术还保护CiP-G175F蛋白的如下应用：对过氧化物酶底物进行氧化反应。所述应用中，底物为ABTS或TMB。所述应用中，反应条件为pH4.5。所述应用中，反应体系为pH4.5、50mM醋酸缓冲溶液。本专利技术还保护一种制备CiP-G175F蛋白的方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，得到CiP-G175F蛋白。所述培养的具体方法为：取所述重组菌，接种至发酵培养基(初始OD600nm值为10-16，具体可为12)，30℃、200rpm振荡培养84小时；培养过程中，分别于培养24小时后、培养36小时后、培养48小时后、培养60小时后和培养72小时后向体系中加入甲醇，每次加入甲醇后体系中的甲醇浓度为0.5％(体积分数)。所述方法还包括如下步骤：①完成所述培养后，离心收集上清液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液；②取步骤①得到的滤液，装入透析袋中，将透析袋置于pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中透析，然后浓缩，然后用0.2μm滤膜过滤并收集滤液；③取步骤②得到的滤液，脱盐、浓缩，然后进行FPLC纯化。FPLC纯化的方法如下：层析柱：阴离子柱HiTrapDEAEFF(GEHealthcare，产品目录编号为：17-5154-01)，柱体积为5ml；洗脱过程(流速1ml/min)：先用pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分平衡柱子；然后上样1ml浓缩蛋白液；然后用50mlpH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤；然后用A液和/或B液作为流动相进行洗脱(A液为pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，B液为含1MNaCl的pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱时间为80min)，从洗脱初始时刻至洗脱终止时刻，A液占流动相的体积百分比由100％线性降低至0％，收集洗脱过程中保留时间为40min-50min的过柱后溶液，得到CiP-G175F蛋白溶液。本专利技术还保护一种制备过氧化物酶的方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，得到过氧化物酶。所述培养的具体方法为：取所述重组菌，接种至发酵培养基(初始OD600nm值为10-16，具体可为12)，30℃、200rpm振荡培养84小时；培养过程中，分别于培养24小时后、培养36小时后、培养48小时后、培养60小时后和培养72小时后向体系中加入甲醇，每次加入甲醇后体系中的甲醇浓度为0.5％(体积分数)。所述方法还包括如下步骤：①完成所述培养后，离心收集上清液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液；②取步骤①得到的滤液，装入透析袋中，将透析袋置于pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中透析，然后浓缩，然后用0.2μm滤膜过滤并收集滤液；③取步骤②得到的滤液，脱盐、浓缩，然后进行FPLC纯化。FPLC纯化的方法如下：层析柱：阴离子柱HiTrapDEAEFF(GEHealthcare，产品目录编号为：17-5154-01)，柱体积为5ml；洗脱过程(流速1ml/min)：先用pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分平衡柱子；然后上样1ml浓缩蛋白液；然后用50mlpH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤；然后用A液和/或B液作为流动相进行洗脱(A液为pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，B液为含1MNaCl的pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱时间为80min)，从洗脱初始时刻至洗脱终止时刻，A液占流动相的体积百分比由100％线性降低至0％，收集洗脱过程中保留时间为40min-50min的过柱后溶液，得到过氧化物酶溶液。本专利技术提供的过氧化物酶，发挥功能的单元为单一蛋白质，更加适用于工业化大规模生产。本专利技术提供的过氧化物酶，比活力高、底物亲和度高、底物谱广、性质稳定，可应用于清除废水中酚类物质、降解苯类物质、催化染料脱色、生物传感器、医药领域等多个领域，生产不受地域和气候限制。本专利技术具有重大的应用推广价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pPIC9K载体：Invitrogen，其产品目录号为V17520；pPIC9K载体中位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为AOX1启动子，在AOX1启动子下游且MCS上游有信号肽，信号肽带有起始密码子ATG，因此在MCS处插入的外源基因可以没有起始密码子，只要三联密码子与之相符，没有移码即可，在蛋白表达加工本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，如序列表的序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，如序列表的序列1所示。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)或(3)：(1)编码区序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码过氧化物酶的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码过氧化物酶的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡美荣，陈榕，陈飞，牟庆璇，陶勇，
申请(专利权)人：福建力多利生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35