一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法技术

本发明专利技术公开了一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，是通过TC表达框对杆状病毒转移载体pFBDM‑IG进行改造，通过提高细胞活率和延长蛋白表达时间来增加甲状腺过氧化物酶在杆状病毒表达系统中的表达量。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的表达方法，包含有：杆状病毒反式激活因子IE0/1，嵌合启动子HPP，杆状病毒极晚期启动子polh，内部核糖体进入位点IRES基因和GFP基因，其中GFP基因表达可以产生绿色荧光蛋白，用于在病毒转染和感染时的细胞荧光观察；方法为：TC表达框构建，转移载体pFBDM‑TC‑TPO‑IG构建，Tn7位点转座，重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒和甲状腺过氧化物酶表达量检测。本发明专利技术将甲状腺过氧化物酶表达量增加了约1.7倍，有效提高了甲状腺过氧化物酶的表达量。

An expression method for increasing the expression of thyroid peroxidase

The invention discloses a method for increasing thyroid peroxidase expression expression, is the frame transformation vector pFBDM IG of baculovirus transfer through the expression of TC, the expression of the improved survival rate and prolong the time to increase the expression of thyroid peroxidase in the baculovirus expression system in cells. The invention has the advantages that the invention provides expression method, including: baculovirus transactivator IE0/1 chimeric promoter HPP, baculovirus late promoter POLH, internal ribosome entry site of IRES gene and GFP gene, the expression of GFP gene can produce green fluorescent protein, used to observe the fluorescence in the cell transfection and infection; methods: the expression of TC frame construction, transfer vector pFBDM TC TPO IG construction site of Tn7 transposon, the recombinant E.coli Sf9 cells infected with recombinant baculovirus and thyroid peroxidase expression detection. The present invention increases the expression of thyroid peroxidase by about 1.7 times, and effectively improves the expression of thyroid peroxidase.

【技术实现步骤摘要】
一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法。
技术介绍
甲状腺过氧化物酶(thyroidperoxidase,TPO)是一种含有血红素辅基的膜结合糖蛋白，整个分子分为膜内区，跨膜区和膜外区，cDNA全长3kb，跨膜区的存在使TPO在表达时难以分泌出来，具有催化活性的部分伸向充满胶质滤泡腔的内部。TPO作为甲状腺激素在生物机体内合成过程中的一种重要酶，能参与催化碘的活化、甲状腺球蛋白上酪氨酸残基的碘化及碘化酪氨酸残基的偶联过程，最终生成甲状腺素(T3、T4)。TPO同时也是甲状腺微粒体的主要抗原组成成分，当生物体甲状腺发生病变，导致滤泡细胞的生物结构受到破坏时，TPO随即经过甲状腺滤泡细胞腔的边缘部分即甲状腺细胞顶部的部位向外周血进行遗漏，从而刺激机体进行免疫系统调节，免疫系统随即产生TPO抗体(TPO-Ab)以应对刺激。人体自身免疫性甲状腺疾病(Autoimmunethyroiddiseases，AITD)的发病机理是由T细胞介导的器官特异自身免疫性疾病，其生物学特征是患者血清内会产生针对甲状腺抗原的多种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，是通过TC表达框对杆状病毒转移载体pFBDM‑IG进行改造，通过提高细胞活率和延长蛋白表达时间来增加甲状腺过氧化物酶在杆状病毒表达系统中的表达量；所述TC表达框包括嵌合启动子HPP和杆状病毒反式激活因子IE0/1。

【技术特征摘要】
1.一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，是通过TC表达框对杆状病毒转移载体pFBDM-IG进行改造，通过提高细胞活率和延长蛋白表达时间来增加甲状腺过氧化物酶在杆状病毒表达系统中的表达量；所述TC表达框包括嵌合启动子HPP和杆状病毒反式激活因子IE0/1。2.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，提高细胞活率是指利用极晚期启动子polh驱动杆状病毒反式激活因子IE0/1的表达。3.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，延长蛋白表达时间是指利用嵌合启动子HPP替换晚期启动子p10来驱动甲状腺过氧化物酶基因的表达。4.根据权利要求1所述的一种增加甲状腺过氧化物酶表达量的表达方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)TC表达框的构建：利用融合PCR构建嵌合启动子HPP，所述嵌合启动子HPP包括转录增强序列hr1、杆状病毒强启动子p10和p6.9；利用PCR方法分别获得IE0基因、IE1基因，然后以重叠PCR方法将IE0基因和IE1基因融合为IE0/1基因，利用常规酶切克隆方法将IE0/1基因克隆于pFBDM-IG转移载体的polh启动子下游，将嵌合启动子替换p10启动子，获得含有TC表达框的杆状病毒转移载体pFBDM-TC-IG；2)转移载体pFBDM-TC-TPO-IG的构建：将TPO-pMD19Tsimple载体和pFBDM-TC-IG载体分别用EcoRI和SalI进行酶切、胶回收、连接、转化、酶切验证和测序，得到正确的pFBDM-TC-TPO-IG；3)Tn7位点的转座：制备AcMultiBac/rSW106-inv+asd-感受态细胞，加入5μLpFBDM-TC-TPO-IG质粒，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2min，然后加入800μL含有DAP的LB培养基，32℃200rpm恒温摇床上振荡培养6h，涂布含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP/IPTG/X-gal的固体LB平板上，32℃培养箱中培养24～48h，直至出现蓝白斑；挑取3～5个白斑于含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的LB培养液中32℃220rpm振荡培养，然后用TPO特异性引物进行菌液PCR验证，验证正确的菌液保存备用；4)重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒：将构建的pFBDM-TC-TPO-IG/rSW106-inv+asd-重组菌液，按照以下方法感染Sf9细胞：用含8％FBS的Grace's培养基培养Sf9细胞于50mL培养瓶中，当细胞生长70％到80％单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘阳坤，姚伦广，尹延震，王铁军，胡小敏，李娜，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41