一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用，所述氨基酸脱氢酶突变体具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1‑15个氨基酸；其中，所述突变体具有氨基酸脱氢酶的活性。本发明专利技术中通过设计41至301位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了氨基酸脱氢酶的催化活性，还可以降低氨基酸脱氢酶的使用量。

【技术实现步骤摘要】
一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
氨基酸是至少有一个羧基和一个氨基的两性化合物，按照氨基酸的存在方式，可以分为天然氨基酸和非天然氨基酸两类，天然氨基酸是自然界中存在的氨基酸，非天然氨基酸是由人工合成的氨基酸，一般是在天然氨基酸的侧链上引入一些基团以优化其性能。氨基酸及其衍生物因为其特殊的结构的性质在农业，工业，化工，食品，医药等方面有着广泛的应用。光学活性的非天然氨基酸是一些生物活性肽的手性合成单元，也是许多药物和精细化学品的重要中间体。由酮酸经过不对称还原氨化制备氨基酸是非天然氨基酸生产的重要方法，CN104016872A公开了一种手性α-非天然氨基酸的合成方法，在钯催化剂、氧化剂作用下进行反应生成α-非天然氨基酸；CN101759601A公开了利用过渡金属配合物制备手性α-非天然氨基酸的方法，该专利技术采用金属络合剂代替强酸性体系进行解络合，可以用于合成侧链含有对酸敏感基团的手性α-非天然氨基酸；与上述化学法相比，酶催化方法具有反应条件温和，反映过程不需要有机溶剂，不需要添加金属催化，立体选择性较高等优点。苯丙氨酸脱氢酶催化天然氨基酸苯丙氨酸的氧化脱氨或还原氨化。然而对于苯环上取代的非天然氨基酸催化效率很低，酶的使用量很大。一般而言，可以通过定向进化的手段对野生型酶进行改造，提高酶的各种性质，从而可以应用在生产中。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种氨基酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用，所述氨基酸脱氢酶突变体，提高了其转化效率，稳定性，有利于其在制药领域中的应用。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种氨基酸脱氢酶突变体，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1-15个氨基酸；其中，所述突变体具有氨基酸脱氢酶的活性。本专利技术中，专利技术人通过设计41至301位氨基酸的多个不同位点的突变，从而对氨基酸脱氢酶的性质进行考察，发现这些位点的突变会提高氨基酸脱氢酶的活性，还可以降低酶的使用量，专利技术人进一步发现，通过在41至301位氨基酸的多个不同位点的突变，可以提高氨基酸脱氢酶的酶活至少1倍以上。本专利技术中，所述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列如下：MRDVFEMMDRYGHEQVIFCRHPQTGLKAIIALHNTTAGPALGGCRMIPYASTDEALEDVLRLSKGMTYKCSLADVDFGGGKMVIIGDPKKDKSPELFRVIGRFVGGLNGRFYTGTDMGTNPEDFVHAARESKSFAGLPKSYGGKGDTSIPTALGVFHGMRATARFLWGTDQLKGRVVAIQGVGKVGERLLQLLVEVGAYCKIADIDSVRCEQLKEKYGDKVQLVDVNRIHKESCDIFSPCAKGGVVNDDTIDEFRCLAIVGSANNQLVEDRHGALLQKRSICYAPDYLVNAGGLIQVADELEGFHEERVLAKTEAIYDMVLDIFHRAKNENITTCEAADRIVMERLKKLTDIRRILLEDPRNSARR.在本专利技术的另一些实施例中，氨基酸脱氢酶的多个不同位点的突变体的氨基酸序列与氨基酸脱氢酶的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，且具有氨基酸脱氢酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列与氨基酸脱氢酶的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，且具有氨基酸脱氢酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，氨基酸脱氢酶突变体的氨基酸序列与氨基酸脱氢酶的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，且具有氨基酸脱氢酶的活性。本专利技术中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化中的任意一种或至少两种的组合。所述取代为1-15个，例如可以是取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个，优选为1-9个。本专利技术中，所述氨基酸脱氢酶突变体能够催化酮酸还原为氨基酸，所述酮酸类化合物为其中，R1选自C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基、C5～C10杂芳基、R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基、C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，R2选自单键、C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基、C5～C10杂芳基、R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，所述R2选自单键；优选地，所述酮酸类化合物如式I所示；具体反应式如下：根据本专利技术，所述突变体的取代为第41位、第66位、第77位、第112位、第114位、第135位、第294位、第297位或第301位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。根据本专利技术，所述突变体的突变位点为L41A、M66A、M66V、F77A、F77V、Y112A、Y112V、Y112F、G114A、G114T、A135N、A135V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V、L294T、V297A或L301A中的任意一个或至少两个的组合。本专利技术中，通过进一步实验验证，专利技术人发现这20个位点的突变，能够进一步提高氨基酸脱氢酶的性质，其中，第41位、第66位、第77位、第112位、第114位、第135位、第294位、第297位或第301位的突变会明显提高氨基酸脱氢酶的催化活性，突变体的催化活性相比于野生型酶本身提高不小于1倍，e.e.值能够达到99％以上。根据本专利技术，所述取代为第66位、第77位、第112位、第135位、第294位或第301位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。根据本专利技术，所述突变体的突变位点为M66A、M66V、F77V、Y112A、Y112V、Y112F、A135N、A135V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V、L294T或L301A中的任意一个或至少两个的组合。本专利技术中，通过进一步实验验证，专利技术人发现这6个位点的突变，能够进一步提高氨基酸脱氢酶的性质，其中，第66位、第77位、第112位、第135位、第294位或第301位的突变会明显提高氨基酸脱氢酶的催化活性，突变体的催化活性相比于野生型酶本身提高不小于3倍，e.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氨基酸脱氢酶突变体，其特征在于，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1‑15个氨基酸；其中，所述突变体具有氨基酸脱氢酶的活性。

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸脱氢酶突变体，其特征在于，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的41至301位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1-15个氨基酸；其中，所述突变体具有氨基酸脱氢酶的活性。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述取代为取代1-9个氨基酸；优选地，所述突变体的取代为第41位、第66位、第77位、第112位、第114位、第135位、第294位、第297位或第301位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；优选地，所述突变体的突变位点为L41A、M66A、M66V、F77A、F77V、Y112A、Y112V、Y112F、G114A、G114T、A135N、A135V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V、L294T、V297A或L301A中的任意一个或至少两个的组合。3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述取代为第66位、第77位、第112位、第135位、第294位或第301位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；优选地，所述突变体的突变位点为M66A、M66V、F77V、Y112A、Y112V、Y112F、A135N、A135V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V、L294T或L301A中的任意一个或至少两个的组合；优选地，所述取代为第66位、第112位、第135位或第294位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；优选地，所述突变体的突变位点为M66A、Y112V、A135L、A135F、A135T、L294A、L294V或L294T的任意一个或至少两个的组合。4.根据权利要求1-3中任一项所述的突变体，其特征在于，所述突变体的取代为第66位和第294位的两个氨基酸被取代，第77位和第294位的两个氨基酸被取代，第112位和第294位的两个氨基酸被取代，第114位和第294位的两个氨基酸被取代，第135位和第294位的两个氨基酸被取代，第294位和第297位的两个氨基酸被取代，第294位和第301位的两个氨基酸被取代，第66位、第135位和第294位的三个氨基酸被...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢江平，张娜，焦学成，李瑞，张克俭，张瑜，杨益明，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12