耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种耐药基因mcr‑4/5/8荧光定量PCR检测方法。本发明专利技术保护引物组合，由序列表的序列1至序列6所示的单链DNA组成。本发明专利技术建立的一种针对这三种mcr基因的基于SYBR染料的荧光定量PCR方法。该检测方法具有快速，灵敏度高，特异性强的技术优点，适用于临床和畜牧养殖业多黏菌素耐药基因mcr‑4/5/8流行状况的监测。

Detection of drug resistance gene mcr-4/5/8 by fluorescence quantitative PCR

The invention discloses a fluorescence quantitative PCR detection method for drug resistance gene MCR 4/5/8. The invention protects primer combinations consisting of single chain DNA shown in sequence 1 of sequence list to sequence 6. A fluorescent quantitative PCR method based on SYBR dye for these three MCR genes is established. The method is rapid, sensitive and specific. It is suitable for monitoring the prevalence of polymyxin resistance gene mcr_4/5/8 in clinical and animal husbandry.

【技术实现步骤摘要】
耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法
本专利技术涉及生物
中细菌的分子生物学检测方法，具体一种耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
多黏菌素被认为是治疗多重耐药阴性菌感染的“最后一道防线”，其耐药率在一段时期内保持在比较低的水平。自2016年，我国首次报道了由质粒介导并可高频率水平转移的多黏菌素耐药基因mcr-1，目前世界上40多个国家和地区相继报道了mcr-1基因，引起了全世界的广泛关注。目前，7种新型黏菌素耐药基因mcr-2～8相继发现。这8种mcr基因均可通过质粒传播，不仅促进了临床上多黏菌素耐药性的发展，也导致多黏菌素耐药性在畜牧业和各种环境中广泛流行。多黏菌素耐药性的快速发展给公共卫生安全和畜牧业发展构成了严重威胁。然而，传统的检测方法，如常规PCR和Sanger测序，耗时耗力。目前没有针对mcr-4/5/8的荧光定量PCR检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法。本专利技术提供了一套引物组合甲，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ组成；所述引物对Ⅰ由引物F1和引物R1组成；所述引物F1为如下(a1)或(a2):(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述R1为如下(a3)或(a4):(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物对Ⅱ由引物F2和引物R2组成；所述引物F2为如下(b1)或(b2):(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物R2为如下(b3)或(b4):(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物对Ⅲ由引物F3和引物R3组成；所述引物F3为如下(c1)或(c2):(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物R3为如下(c3)或(c4):(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。所述引物组合甲的用途为如下(1)或(2)：(1)检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因；(2)制备用于检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的试剂盒。本专利技术还保护所述引物组合甲的应用，为如下(1)或(2)：(1)检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因；(2)制备用于检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的试剂盒。本专利技术还保护含有所述引物组合甲的试剂盒；所述试剂盒的用途为检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本专利技术还保护一种待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别采用引物对I至引物对Ⅲ进行PCR扩增，如果采用引物对I可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-4基因；如果采用引物对Ⅱ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-5基因；如果采用引物对Ⅲ可以实现对模板的阳性扩增，待测样本携带mcr-8基因。本专利技术还保护一种检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：检测待测样本的核酸中是否含有引物对I至引物对Ⅲ的靶序列，如果所述核酸中含有引物对I的靶序列，待测样本携带mcr-4耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅱ的靶序列，待测样本携带mcr-5耐药基因；如果所述核酸中含有引物对Ⅱ的靶序列，待测样本携带mcr-8耐药基因。所述引物对I的靶序列具体可如序列表的序列7所示。所述引物对Ⅱ的靶序列具体可如序列表的序列8所示。所述引物对Ⅲ的靶序列具体可如序列表的序列9所示。本专利技术还保护一种检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的方法，包括如下步骤：以待测样本的核酸为模板，分别采用权利要求1中的引物对I至引物对Ⅲ进行荧光定量PCR扩增，根据Ct值对待测样本中的mcr基因进行定量。所述定量方法为将Ct值作为Y值代入标准曲线方程，得到的X值为目的基因的拷贝数。mcr-4耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.4681logX+39.567。mcr-5耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.4111logX+39.657。mcr-8耐药基因的标准曲线方程为：Y＝-3.4371logX+40.861。以上任一所述PCR扩增的反应体系具体可为：上游引物0.8μl，下游引物0.8μl,2×TaqPCRMasterMix10μl,无核酸水6.4μl，DNA模版2μl。PCR扩增反应程序具体可为：预变性95℃，5min；30×(变性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s)；延伸72℃，10min。上游引物和下游引物在体系中的浓度均为0.4pmol/μL。以上任一所述荧光定量PCR扩增的反应体系具体可为：PowerUpTMSYBRTMGreenMasterMix(2×)10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，Rnase-Free水6.4μL，模板2μL。荧光定量PCR扩增的反应反应程序具体可见表3。本专利技术还保护引物组合乙，为如下(a)或(b)：(a)所述引物对Ⅰ或所述引物对Ⅱ或所述引物对Ⅲ；(b)所述引物对Ⅰ、所述引物对Ⅱ、所述引物对Ⅲ中的任意两个引物对的组合。本专利技术还保护所述引物组合乙在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒的用途为检测待测样本中的多黏菌素耐药基因。本专利技术还保护含有所述引物组合乙的试剂盒，所述试剂盒的用途为检测待测样本中的多黏菌素耐药基因。以上任一所述mcr基因具体可为mcr-4耐药基因和/或mcr-5耐药基因和/或mcr-8耐药基因。本专利技术建立的一种针对这三种mcr基因的基于SYBR染料的荧光定量PCR方法。该检测方法具有快速，灵敏度高，特异性强的技术优点，适用于临床和畜牧养殖业多黏菌素耐药基因mcr-4/5/8流行状况的监测。附图说明图1为耐药基因mcr-4/5/8引物对阳性菌DNA的扩增产物电泳图。图2为荧光定量PCR检测的扩增曲线。图3为荧光定量PCR检测的溶解曲线。图4为标准曲线。图5为菌株荧光定量PCR检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pDM19-T载体：Takara宝生物工程(大连)有限公司，货号：6013。实施例1、引物的设计及制备进行大量序列分析、比对获得了用于检测耐药基因mcr-4/5/8的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用于检测耐药基因mcr-4/5/8的引物组，具体如表1所示。表1mcr-4/5/8基因的引物信息表引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组合甲，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ组成；所述引物对Ⅰ由引物F1和引物R1组成；所述引物F1为如下(a1)或(a2):(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述R1为如下(a3)或(a4):(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物对Ⅱ由引物F2和引物R2组成；所述引物F2为如下(b1)或(b2):(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物R2为如下(b3)或(b4):(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物对Ⅲ由引物F3和引物R3组成；所述引物F3为如下(c1)或(c2):(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物R3为如下(c3)或(c4):(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.引物组合甲，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ组成；所述引物对Ⅰ由引物F1和引物R1组成；所述引物F1为如下(a1)或(a2):(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述R1为如下(a3)或(a4):(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物对Ⅱ由引物F2和引物R2组成；所述引物F2为如下(b1)或(b2):(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物R2为如下(b3)或(b4):(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物对Ⅲ由引物F3和引物R3组成；所述引物F3为如下(c1)或(c2):(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物R3为如下(c3)或(c4):(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。2.权利要求1所述引物组合甲的应用，为如下(1)或(2)：(1)检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因；(2)制备用于检测待测样本中的3种多黏菌素耐药基因的试剂盒。3.含有权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王少林，史晓敏，李一鸣，刘园园，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11