用于检测嗜酸硫杆菌的引物对及设计方法与检测方法技术

本发明专利技术公开了用于检测嗜酸硫杆菌的引物对及设计方法与检测方法，其中，设计方法，包括：根据NCBI中的嗜酸性硫杆菌属模式物种菌株的基因组全序列，提取CDSs序列；采用Blastn比对获得嗜酸硫杆菌属保守CDSs序列，并根据引物设计原则，设计得到用于检测嗜酸硫杆菌属的引物对。本方法设计的引物对检测嗜酸硫杆菌时，能够快速、准确地检测出嗜酸硫杆菌属（种），特异性强、灵敏度高，目前还没有采用类似的方法来获取嗜酸硫杆菌属或种的保守CDSs序列进而设计相应的特异性引物。

【技术实现步骤摘要】
用于检测嗜酸硫杆菌的引物对及设计方法与检测方法
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对及设计方法与检测方法。
技术介绍
生物湿法冶金技术已成为贫矿浸取与预处理最具潜力的技术之一，在浸矿微生物中应用最为广泛的是嗜酸硫杆菌属（Acidithiobacillussp.）。嗜酸硫杆菌属中，常见的与浸矿应用相关的物种有嗜酸性氧化亚铁硫杆菌、嗜酸性氧化硫硫杆菌（Acidithiobacillusthiooxidans）和嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacilluscaldus）等。目前，对环境样品中嗜酸硫杆菌属（种）的检测及物种组成分析，主要采用16SrRNA扩增子测序和宏基因组测序的高通量测序方法。但是这两种方法成本高、耗时长，且需要提取高质量样品总DNA。此外，对于物种多样性丰富的环境样品，由于嗜酸硫杆菌属（种）的细胞浓度非常低，测序深度如果不够，其序列很容易被丰度高的物种掩盖而造成假阴性结果，而且即便能检测出来，也需要投入大量的人力与财力。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对及设计方法与检测方法，旨在解决现有的检测方法成本高、耗时长以及嗜酸硫杆菌属（种）的细胞浓度非常低时易出现假阴性结果。本专利技术的技术方案如下：一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对的设计方法，包括如下：步骤A1、根据NCBI中的嗜酸性硫杆菌属模式物种菌株的基因组全序列，提取CDSs序列；步骤B1、以提取的CDSs序列为查询序列，Blastn比对除去嗜酸性硫杆菌属序列的NR数据库，以未比对上的CDSs序列为查询序列，Blastn比对嗜酸性硫杆菌属序列，并提取能比对上NR数据库所有嗜酸性硫杆菌属菌株的CDSs序列，得到嗜酸硫杆菌属保守CDSs序列；步骤C1、根据所述嗜酸硫杆菌属保守CDSs序列及引物设计原则，设计得到用于检测嗜酸硫杆菌属的引物对；或者步骤A2、根据NCBI中的嗜酸性硫杆菌目标种模式菌株的基因组全序列，提取CDSs序列；步骤B2、以提取的CDSs序列为查询序列，Blastn比对除去嗜酸性硫杆菌目标种序列的NR数据库，以未比对上的CDSs序列为查询序列，Blastn比对嗜酸性硫杆菌目标种序列，并提取能比对上NR数据库所有嗜酸性硫杆菌目标种菌株的CDSs序列，得到嗜酸性硫杆菌目标种保守CDSs序列；步骤C2、根据所述嗜酸性硫杆菌目标种保守CDSs序列及引物设计原则，设计得到所述用于检测嗜酸性硫杆菌目标种的引物对。一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对，采用如上所述的设计方法设计而成。所述的用于检测嗜酸硫杆菌的引物对，包括：用于检测嗜酸硫杆菌属的引物对：上游引物序列为5’-CGAGAGCACAGCCAACTGGAACTC-3’，下游引物序列为5’-GCGAGATAGATGCCATGCGCGA-3’；或者用于检测嗜酸性氧化亚铁硫杆菌种的引物对：上游引物序列为5’-GGCACATGTGGTAATTTTGGGT-3’；下游引物序列为5’-CCCGTAGGCAAAGACGTCC-3’。一种检测嗜酸硫杆菌的方法，包括如下：步骤A3、提取待测样品的DNA，并将样品的DNA热裂解，得到DNA单链；步骤B3、采用如上所述的引物对，对所述DNA单链进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；步骤C3、将所述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。所述的检测嗜酸硫杆菌的方法，其中，所述步骤A3包括步骤：将待测样品加入到TE缓冲液中，于92~98℃下水浴4~6min，然后于-18~-22℃下冷冻4~6min，重复水浴和冷冻的步骤一次，再进行分离处理得到含有所述DNA单链的上清液。所述的检测嗜酸硫杆菌的方法，其中，所述步骤B3中，PCR程序设置为30个循环。所述的检测嗜酸硫杆菌的方法，其中，所述步骤C3之后，还包括：步骤D3、将所述扩增产物进行测序并构建分子进化树，用于判断样品中的嗜酸硫杆菌属菌群的组成或同种菌株之间的进化聚类关系。有益效果：本专利技术提供了一种如上所述的用于检测嗜酸硫杆菌的引物对的设计方法，本方法设计的引物对检测嗜酸硫杆菌时，能够快速、准确地检测出嗜酸硫杆菌属（种），特异性强、灵敏度高，目前还没有采用类似的方法来获取嗜酸硫杆菌属或种的保守CDSs序列进而设计相应的特异性引物。附图说明图1为本专利技术实施例1和实施例2中嗜酸硫杆菌属（种）保守CDSs序列获取及特异性引物设计流程图。图2为本专利技术实施例1和实施例2中嗜酸硫杆菌属（种）特异性引物快速鉴定PCR产物电泳图。图3为本专利技术实施例1中的嗜酸硫杆菌属特异性引物PCR产物分析结果。图4为本专利技术实施例2中的嗜酸性氧化亚铁硫硫杆菌种特异性引物PCR产物分析结果。具体实施方式本专利技术提供了一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对及设计方法与检测方法，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供了一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对的设计方法的较佳实施例，包括如下步骤：（1）保守序列的获取从美国国家生物技术信息中心（NCBI，TheNationalCenterforBiotechnologyInformation）数据库下载嗜酸性硫杆菌属模式物种菌株的基因组全序列，并提取其CDSs（编码序列，为CDS的复数形式）序列。然后以提取的CDSs为查询序列（querysequence），使用Blastn默认参数比对除去嗜酸性硫杆菌属序列的NR数据库。撰写perl语言脚本提取未比对上的CDSs序列，并以其为查询序列，Blastn比对NR数据库中所有嗜酸性硫杆菌属序列，提取在每个物种中出现的序列，即获得嗜酸硫杆菌属保守CDSs序列。按照类似的方法，可以获得特定的嗜酸性硫杆菌种的保守序列，具体为，确定将要检测、鉴定的嗜酸性硫杆菌种（即嗜酸性硫杆菌目标种，简称目标种）后，获得该目标种模式菌株的CDSs序列。以其为查询序列，使用Blastn默认参数比对除去该目标种模式菌株序列的NR数据库，并提取未比对上的CDSs序列，以其为查询序列，Blastn比对NR数据库中所有该目标种的序列，并提取能比对上NR库所有该目标种菌株的CDSs序列，此即该嗜酸性硫杆菌目标种的保守CDSs序列。（2）特异性引物的设计提取嗜酸硫杆菌属的某一CDS的所有保守序列，使用Bioedit软件进行比对分析，确定该CDS在嗜酸硫杆菌属所有物种CDS序列中的保守序列区段，根据该保守序列区段设计特异性PCR引物，获得嗜酸硫杆菌属的快速检测引物。本专利技术以离子外流通透酶基因序列（属）的CDS序列为例，设计得到离子外流通透酶基因序列（属）的特异扩增上、下游引物序列分别为：上游引物序列为5’-CGAGAGCACAGCCAACTGGAACTC-3’，下游引物序列为5’-GCGAGATAGATGCCATGCGCGA-3’。嗜酸性硫杆菌目标种的特异性引物的设计过程为：提取嗜酸性硫杆菌目标种的某一CDS的所有保守序列，使用Bioedit软件进行比对分析，确定该CDS在该种所有菌株CDS序列中的保守序列区段，根据该保守序列区段设计特异性PCR引物，获得嗜酸性硫杆菌目标种的快速检测引物。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对的设计方法，其特征在于，包括如下：步骤A1、根据NCBI中的嗜酸性硫杆菌属模式物种菌株的基因组全序列，提取CDSs序列；步骤B1、以提取的CDSs序列为查询序列，Blastn比对除去嗜酸性硫杆菌属序列的NR数据库，以未比对上的CDSs序列为查询序列，Blastn比对嗜酸性硫杆菌属序列，并提取能比对上NR数据库所有嗜酸性硫杆菌属菌株的CDSs序列，得到嗜酸硫杆菌属保守CDSs序列；步骤C1、根据所述嗜酸硫杆菌属保守CDSs序列及引物设计原则，设计得到用于检测嗜酸硫杆菌属的引物对；或者步骤A2、根据NCBI中的嗜酸性硫杆菌目标种模式菌株的基因组全序列，提取CDSs序列；步骤B2、以提取的CDSs序列为查询序列，Blastn比对除去嗜酸性硫杆菌目标种序列的NR数据库，以未比对上的CDSs序列为查询序列，Blastn比对嗜酸性硫杆菌目标种序列，并提取能比对上NR数据库所有嗜酸性硫杆菌目标种菌株的CDSs序列，得到嗜酸性硫杆菌目标种保守CDSs序列；步骤C2、根据所述嗜酸性硫杆菌目标种保守CDSs序列及引物设计原则，设计得到所述用于检测嗜酸性硫杆菌目标种的引物对。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对的设计方法，其特征在于，包括如下：步骤A1、根据NCBI中的嗜酸性硫杆菌属模式物种菌株的基因组全序列，提取CDSs序列；步骤B1、以提取的CDSs序列为查询序列，Blastn比对除去嗜酸性硫杆菌属序列的NR数据库，以未比对上的CDSs序列为查询序列，Blastn比对嗜酸性硫杆菌属序列，并提取能比对上NR数据库所有嗜酸性硫杆菌属菌株的CDSs序列，得到嗜酸硫杆菌属保守CDSs序列；步骤C1、根据所述嗜酸硫杆菌属保守CDSs序列及引物设计原则，设计得到用于检测嗜酸硫杆菌属的引物对；或者步骤A2、根据NCBI中的嗜酸性硫杆菌目标种模式菌株的基因组全序列，提取CDSs序列；步骤B2、以提取的CDSs序列为查询序列，Blastn比对除去嗜酸性硫杆菌目标种序列的NR数据库，以未比对上的CDSs序列为查询序列，Blastn比对嗜酸性硫杆菌目标种序列，并提取能比对上NR数据库所有嗜酸性硫杆菌目标种菌株的CDSs序列，得到嗜酸性硫杆菌目标种保守CDSs序列；步骤C2、根据所述嗜酸性硫杆菌目标种保守CDSs序列及引物设计原则，设计得到所述用于检测嗜酸性硫杆菌目标种的引物对。2.一种用于检测嗜酸硫杆菌的引物对，其特征在于，采用权利要求1所述的设计方法设计而成。3.根据权利要求2所述的用于检测嗜酸硫杆菌的引物对，其特征在于，包括：用于检测嗜酸硫杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛艳萍，蔡勋超，刘长坤，杨波，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44