miR-216a及其靶基因在血管衰老和动脉粥样硬化性心脏病中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与血管内皮衰老和炎症反应、老年冠状动脉粥样硬化疾病以及动脉粥样硬化斑块稳定性相关的生物标记物miR‑216a及其靶基因Smad3和Smad7，并证实miR‑216a在动脉粥样硬化患者组织或血液样本中表达上调；也证实miR‑216a在具有不稳定动脉粥样硬化斑块的人群中特异性高表达；本发明专利技术还公开了miR‑216a及其抑制剂在制备用于评估个体中动脉粥样硬化斑块稳定性以及冠心病发生风险的产品中的用途。利用所述miR‑216a可以在老年冠状动脉粥样硬化发生的早期进行评估诊断或对动脉粥样硬化斑块稳定性和进展进行评估预测，不仅对冠状动脉粥样硬化的早期治疗和医疗成本的节约有重要意义，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。

Application of miR-216a and its target genes in vascular aging and atherosclerotic heart disease

The invention discloses a biomarker microRNA 216a and its target genes Smad3 and Smad7 related to vascular endothelial aging and inflammation, elderly coronary atherosclerosis disease and atherosclerotic plaque stability, and confirms that the expression of microRNA 216a is up-regulated in tissues or blood samples of atherosclerotic patients. The present invention also discloses the use of microRNA 216a and its inhibitors in the preparation of products for assessing the stability of atherosclerotic plaques in individuals and the risk of coronary heart disease. The microRNA 216a can be used to evaluate and diagnose the early onset of coronary atherosclerosis in the elderly or to evaluate and predict the stability and progress of atherosclerotic plaques. It is not only of great significance for the early treatment of coronary atherosclerosis and the cost savings of medical treatment, but also for the clinical treatment of gene therapy and drug therapy. The application provides therapeutic targets and important basis.

【技术实现步骤摘要】
miR-216a及其靶基因在血管衰老和动脉粥样硬化性心脏病中的应用
本专利技术涉及检验医学、临床医学、生物
，具体涉及miR-216a及其靶基因在血管衰老和动脉粥样硬化性心脏病中的应用。
技术介绍
动脉粥样硬化及其心血管并发症如性心肌梗死、不稳定型心绞痛和缺血性脑卒等严重威胁人类健康。衰老是动脉粥样硬化发生的独立危险因素。血管内皮细胞衰老导致的内皮炎症反应和功能障碍是动脉粥样硬化发生发展的起始阶段。体内研究进一步表明，与正常血管相比，人动脉粥样硬化斑块处的内皮细胞出现显著的衰老表型。然而内皮细胞衰老和功能障碍的分子机制并不完全清楚。遗传、表观遗传及环境因素共同影响血管老化和炎症反应，参与动脉粥样硬化发生发展过程。微小RNAs(MicroRNAs，简称MiRNAs)是表观遗传因素中重要的调控者之一。MiRNAs是一类长约22个核苷酸的单链非编码RNA分子，可在转录后水平结合靶基因mRNA的3’非翻译区(Untranslatedregion，UTR)，引导沉默复合体降解mRNA，终止翻译，调控生物体内1/3以上的基因表达。越来越多的体内外研究表明miRNAs参与调控血管衰老和炎症反应过程，如miR-217、miR-34a、miR-146a和miR-181b等。microRNA-216a(miR-216a)位于2号染色体非编码基因DA73的第二个内含子上，在前体miR-216a加工过程中，miR-216a-3p降解，生成成熟体miR-216a-5p，在人、小鼠、大鼠、斑马鱼等物种间保守表达。MiR-216a在血管内皮细胞衰老和内皮炎症反应中的作用尚无报道，miR-216a能否作为动脉粥样硬化斑块稳定性以及冠心病等心血管疾病的血清学标志物尚需阐明。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种用于老年冠状动脉粥样硬化疾病的早期诊断以及用于动脉粥样硬化斑块稳定性的早期预测的血清学循环生物标志物microRNA-216a(miR-216a)及其应用；本专利技术的目的之二在于提供所述miR-216a调控的靶基因Smad3和/或Smad7在制备预防、诊断或治疗血管内皮衰老和炎症反应以及老年冠状动脉粥样硬化疾病产品中的应用；或在制备预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性的产品中应用；本专利技术目的之三在于提供一种miR-216a抑制剂及其应用。为实现上述目的，本专利技术首先提供miR-216a在如下I、II或III中的应用：I、制备预防、早期诊断或治疗血管内皮衰老和炎症反应以及老年动脉粥样硬化产品中的应用；II、制备调控基因Smad3和/或Smad7介导的TGFβ1信号通路的抗炎产品中的应用；III、在制备用于预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性产品中的应用。优选的，所述miR-216a在衰老HUVECs和动脉粥样硬化患者样本中表达上调；优选的，所述miR-216a在具有不稳定动脉粥样硬化斑块的人群中特异性高表达。优选的，所述预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性是通过测定所述个体的血液样本或组织样本中的miR-216a表达情况，与对照相比，miR-216a表达水平是否升高，来预测所述动脉粥样硬化斑块的稳定性。优选的，所述对照为个体中具有稳定的动脉硬化斑块(钙化斑块)。优选的，所述对照是指来自例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或者例如至少100位个体的一系列样本中的miR-216a表达水平。优选的，所述提供用于检测miRNA的方法也是在本专利技术的一般范围内。该方法常常涉及样本miRNA提取、逆转录反应、PCR扩增。本专利技术也可通过监测不同时间点个体中miR-216a表达量情况，可以跟踪动脉粥样硬化斑块的稳定性作用的发展。进一步地，本专利技术提供miR-216a调控的靶基因Smad3和/或Smad7在制备预防、诊断或治疗血管内皮衰老和炎症反应以及老年动脉粥样硬化产品中的应用；或在制备预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性产品中的应用。本专利技术所述产品包括试剂、试剂盒、药物或保健品。优选的，所述miR-216a调控基因Smad3和/或Smad7是通过miR-216a与所述Smad3和/或Smad7基因3’端非转录区域靶位点结合。优选的所述miR-216a与Smad3基因3’端非转录区域靶位点结合为与ENST00000327367.8所示序列中第790-796位核苷酸结合；所述miR-216a与Smad7基因3’端非转录区域靶位点结合为与ENSG00000101665所示序列中第1230-1236位核苷酸结合。进一步，使用双荧光素酶报告系统实验检测miR-216a对Smad3和/或Smad7的调控作用。进一步地，本专利技术提供一种miR-216a抑制剂，所述miR-216a抑制剂的核苷酸序列为SEQIDNO.1；所述抑制剂能抑制miR-216a表达，促进靶基因Smad3和/或Smad7表达。更进一步地，本专利技术提供所述miR-216a抑制剂在如下I或II中的应用：I、在预防或治疗血管内皮衰老和内皮炎症反应以及老年冠状动脉粥样硬化疾病药物中的应用；II、在制备预防或治疗动脉粥样硬化斑块不稳定试剂或药物中的应用。优选的，所述miR-216a抑制剂促进Smad3和/或Smad7的表达，进而通过Smad3/IκBα/Smad7信号通路介导炎症反应。优选的，所述炎症反应中的炎症因子包括ICAM1(intercellularadhesionmolecule1，细胞间粘附分子1)、VCAM1(vascularcelladhesionmolecule1，血管细胞粘附分子1)和IL1β(interleukin1beta，人白介素1β)。本专利技术提供一种治疗老年动脉粥样硬化药物，所述药物组合物包括所述miR-216a抑制剂以及药剂学上能接受的载体。进一步地，本专利技术还提供了一种老年冠状动脉粥样硬化疾病早期诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增miR-216a、Smad3和Smad7引物，所述特异性扩增miR-216a引物为商业购买，所述特异性扩增Smad3引物如SEQIDNO.20-21，所述特异性扩增Smad7引物如SEQIDNO.30-31。优选的，所述试剂盒通过实时荧光定量PCR检测冠状动脉粥样硬化疾病患者样本中miR-216a表达情况以及miR-216a调控的Smad3和Smad7靶基因的表达情况。优选的，所述冠状动脉粥样硬化疾病患者样本为组织或血液。优选的，所述试剂盒还包括：提取miRNA和RNA试剂，逆转录试剂，实时定量荧光PCR试剂，上述试剂均可商业购买。更进一步，本专利技术提供一种预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性的试剂盒，所述试剂盒包括提取个体血液样本的miRNA试剂、逆转录试剂、实时定量pcr试剂及扩增引物。提取个体血液样本的miRNA试剂可以是商业购买如使用miRNeasyPlasmaKit(#217184，QIAGEN，Hilden，Germany)。逆转录试剂、实时定量pcr试剂及扩增引物可以是商业购买如miScriptIIreversetranscriptionkit(#218161)和miScriptSYBRGr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miR‑216a在如下I、II或III中的应用：I、制备预防、早期诊断或治疗血管内皮衰老和炎症反应以及老年冠状动脉粥样硬化疾病产品中的应用；II、制备调控基因Smad3和/或Smad7介导的TGFβ1信号通路抗炎产品中的应用；III、在制备用于预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性产品中的应用。

【技术特征摘要】
2018.01.17 CN 20181004243461.miR-216a在如下I、II或III中的应用：I、制备预防、早期诊断或治疗血管内皮衰老和炎症反应以及老年冠状动脉粥样硬化疾病产品中的应用；II、制备调控基因Smad3和/或Smad7介导的TGFβ1信号通路抗炎产品中的应用；III、在制备用于预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性产品中的应用。2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述miR-216a在衰老HUVECs和动脉粥样硬化患者样本中表达上调；所述miR-216a在具有不稳定动脉粥样硬化斑块的人群中特异性高表达。3.如权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性是通过测定所述个体的血液样本中的miR-216a表达情况，与对照相比，miR-216a表达水平是否升高。4.miR-216a调控的靶基因Smad3和/或Smad7在制备预防、诊断或治疗血管内皮衰老和炎症反应以及老年冠状动脉粥样硬化疾病产品中的应用；或在制备预测个体中动脉粥样硬化斑块稳定性产品中的应用。5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述miR-216a调控基因Smad3和/或Smad7是通过miR-216a与所述Smad3和/或Smad7基因3’端非转录区域靶位点结合。6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟丽，杨淑均，陈宇，米雪楠，杨云云，李健，
申请(专利权)人：中国医学科学院阜外医院，
类型：发明
国别省市：北京,11