基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针及制备方法和应用技术

一种基于共轭聚合物/金属离子复合物的L‑半胱氨酸荧光探针及制备方法和应用。所述荧光探针是由共轭聚合物与金属离子组成的复合物，其中共轭聚合物为一种侧链含有双羧酸盐的聚噻吩衍生物(PT)，结构式为：

L- cysteine fluorescent probe based on conjugated polymer / metal ion complex and its preparation and Application

A conjugated polymer/metal ion complex based L_cysteine fluorescent probe and its preparation method and application. The fluorescent probe is a complex composed of conjugated polymer and metal ions, wherein the conjugated polymer is a polythiophene derivative (PT) containing dicarboxylate in the side chain, and the structure formula is as follows:

【技术实现步骤摘要】
基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针及制备方法和应用
本专利技术属于荧光传感检测
，特别涉及一种基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
L-半胱氨酸(Cys)是人体内一种非常重要的含巯基氨基酸，它可参与人体内可逆的氧化还原反应过程，具有调节生化途径中的细胞稳态和细胞代谢等多种重要生理功能。生物体内Cys浓度异常，会引发许多疾病。Cys含量过低，会引起儿童生长迟缓、毛发色素脱失、嗜睡、肝脏和皮肤组织损伤以及脂肪损失等症状；而动脉粥样硬化、缺血性脑血管病、高血压综合征、妊娠期糖尿病等疾病都伴随着Cys含量的明显增加。因此，发展高选择性、高灵敏度的Cys检测方法，对深入理解其生物功能及相关疾病的临床检测与治疗，具有重要的科学和实用价值。在各种分析方法中，荧光技术具有操作简单、灵敏度高以及良好的时空分辨性能等特点，在活细胞、活组织甚至活体等原位无损伤检测中展现出独特的优势，荧光技术的核心是荧光探针。目前报道的Cys荧光探针，其检测原理主要是利用Cys中巯基与特定官能团发生反应，从而引起体系荧光的变化，利用体系荧光强度变化与Cys浓度的线性关系，达到定量检测Cys的目的。这类Cys探针中常含有的官能团包括：N-取代的马来酰亚胺，醛基，二硫键，磺酰酯、磺酰胺等。这类Cys荧光探针通常需要一定的反应时间，而且伴随着新物质的生成，可能对检测结果造成一定的影响。最近，基于荧光探针/金属离子组合的Cys检测方法引起了研究者的关注，该方法利用金属离子作为淬灭子，淬灭荧光探针的荧光，而Cys可与金属离子形成更为稳定的复合物，从而释放出自由的荧光探针，使体系的荧光恢复。这种置换的检测策略，避免了新荧光物质的生成，提高了检测的可信度。但目前报道的这类荧光探针通常为有机染料的衍生物，如香豆素，荧光素，萘酚，蒽，联吡啶等，它们通常在水中的溶解度较差，因此对Cys的检测须在有机溶剂或有机溶剂/水的混合体系中进行，大大限制了其在生物体系中的原位检测性能。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决目前Cys荧光探针存在的上述不足，设计合成了一种水溶性的侧链含有双羧酸盐的聚噻吩衍生物，其与金属离子形成复合物荧光探针，可在水溶液中高选择性、高灵敏度、快速检测Cys的含量，也可用作荧光染料对活细胞中的Cys进行标记和荧光成像。本专利技术采用的技术方案是：一种基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸(Cys)荧光探针，所述荧光探针是由共轭聚合物与金属离子组成的复合物，其中共轭聚合物为侧链含有双羧酸盐基团的聚噻吩衍生物(PT)，金属离子为Cu2+，Fe2+，Fe3+，Co3+，Pd2+，Eu3+，Ni2+，Hg2+，Ag+，Ca2+，Cd2+或Zn2+具有顺磁性且能与共轭聚合物结合的离子。共轭聚合物/金属离子复合物荧光探针的检测原理如图1所示：将共轭聚合物溶解在水中，400nm波长的光激发下，溶液有强烈的荧光。向该溶液中加入适量的金属离子，由于金属离子的顺磁性，一旦共轭聚合物与金属离子形成复合物后，金属离子使共轭聚合物的荧光淬灭。当向共轭聚合物/金属离子复合物溶液中逐渐加入Cys，由于Cys可与金属离子通过M-S键的结合，形成更加稳定的络合物Cys-Mn+。因此，随着溶液中Cys含量的增加，金属离子逐渐从共轭聚合物/金属离子复合物中脱离开来，共轭聚合物的荧光重新恢复。根据共轭聚合物荧光强度与Cys浓度的线性关系，可在水中高选择性、高灵敏度、快速检测Cys的含量，也可在活细胞中对Cys进行标记和荧光成像。本专利技术所述的共轭聚合物是一种侧链含有双羧酸盐聚噻吩衍生物，其结构式为：其中R为氢、甲基、乙基、丙基或饱和烷基链；X为碳、氧、硫、硒或碲原子；M为正一价离子锂、钠、钾、银或铵。本专利技术同时提供了一种基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针的制备方法，步骤如下：第1步、共轭聚合物——侧链含有双羧酸盐聚噻吩衍生物的制备以4-位上为氢、甲基、乙基、丙基或饱和烷基链的3-溴-噻吩为起始原料，依次经过醚化反应和亲核取代步骤，得到侧链功能化的单体；将功能化的单体溶于氯仿，以FeCl3为氧化剂，50℃氮气保护下，氧化聚合反应48h，停止反应，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，将所得到固体溶于甲醇，加几滴水合肼，搅拌反应过夜，然后抽滤，滤液旋干得粗产品；将所得粗产品经碱性水解后，转移到截留分子量为3500的透析袋中，透析3天；随后，冷冻干燥得聚合物固体粉末，即为侧链含有双羧酸盐的聚噻吩衍生物。第2步、基于共轭聚合物/金属离子复合物的荧光探针制备第2.1步、将第1步制得的共轭聚合物适量溶解于去离子水中，配制成浓度为5×10-5M的溶液，称为溶液a。第2.2步、取金属氯化物或金属硝酸盐适量溶解于去离子水中，配制成浓度为5×10-3M的溶液，称为溶液b。第2.3步、向上述共轭聚合物溶液a中逐渐加入第2.2步得到的金属离子溶液b，直至共轭聚合物的荧光完全淬灭，得到共轭聚合物/金属离子复合物荧光探针溶液c。一种所述基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针的应用，可实现在水溶液样品中对L-半胱氨酸的定量检测；该复合物荧光探针具有低毒性和良好的生物相容性，可作为荧光染料对活细胞中的L-半胱氨酸进行标记和荧光成像。所述应用的具体步骤如下：应用一、将Cys溶解于去离子水中，配制成浓度为5×10-3M的溶液。向上述共轭聚合物/金属离子复合物荧光探针溶液c中逐渐加入Cys溶液，用400nm波长的光激发，测定溶液在520nm波长的发射光谱，得到共轭聚合物荧光强度与Cys浓度的线性关系标准曲线。根据标准曲线，可定量检测水溶液样品中Cys的含量。应用二、将共轭聚合物/金属离子组合荧光探针溶液c与Hela细胞共培养，用400nm波长的光激发，利用共聚焦激光显微镜，可实现活细胞中Cys的标记和荧光成像。本专利技术的优点和有益效果：1.用于合成荧光探针的原料易得，制备方法简单；2.荧光探针水溶性好，对Cys选择性高，检测速度快，可用于水溶液样品中Cys的定量检测；3.荧光探针毒性低，生物相容性好，可用于活细胞中Cys的标记和荧光成像。附图说明图1是共轭聚合物/金属离子复合物荧光探针检测Cys的原理图。图2是共轭聚合物/金属离子复合物荧光探针连续滴定Cys的荧光光谱图。图3是共轭聚合物/金属离子复合物荧光探针荧光发射强度与Cys浓度的线性关系曲线。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步描述，将有助于对本专利技术的理解。但并不能以此来限制本专利技术的权利范围，而本专利技术的权利范围应以权利要求书阐述的为准。基于共轭聚合物/金属离子复合物的荧光探针的制备实施例1：1.1：3-甲氧基-4-甲基噻吩的合成取3-溴-4-甲基噻吩(2.5g,14mmol)溶于3.8mLNMP中，完全溶解后，将其加至盛有20mL35％甲醇钠的甲醇溶液的三口烧瓶中，再取溴化亚铜(1.5g,10mmol)加入反应中，氮气保护下回流反应24h。冷却至室温，滤去固体，将滤液旋干，加入二氯甲烷溶解，用水萃取。所得有机相加入无水硫酸镁干燥。过滤，旋干，粗产物经柱层析纯化(硅胶，正己烷)后，得到3-甲氧基-4-甲基噻吩1.3g，产率72.2％。1HNMR(400MHz,CDC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于共轭聚合物/金属离子复合物的L‑半胱氨酸荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是由共轭聚合物与金属离子组成的复合物，其中共轭聚合物为一种侧链含有双羧酸盐的聚噻吩衍生物(PT)；该复合物荧光探针的检测原理如下：共轭聚合物PT的水溶液在400nm波长的光激发下发射强烈的荧光，当PT与金属离子(Mn+)形成复合物后，PT的荧光被淬灭；当向该复合物荧光探针水溶液中加入L‑半胱氨酸(Cys)，由于Cys与Mn+能够通过M‑S键形成更加稳定的Cys‑Mn+络合物，从而将PT从PT/Mn+复合物中释放出来，体系荧光恢复；该复合物荧光探针可用于水溶液中Cys的高选择性快速检测，也可用于活细胞中Cys的标记和荧光成像。

【技术特征摘要】
1.一种基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是由共轭聚合物与金属离子组成的复合物，其中共轭聚合物为一种侧链含有双羧酸盐的聚噻吩衍生物(PT)；该复合物荧光探针的检测原理如下：共轭聚合物PT的水溶液在400nm波长的光激发下发射强烈的荧光，当PT与金属离子(Mn+)形成复合物后，PT的荧光被淬灭；当向该复合物荧光探针水溶液中加入L-半胱氨酸(Cys)，由于Cys与Mn+能够通过M-S键形成更加稳定的Cys-Mn+络合物，从而将PT从PT/Mn+复合物中释放出来，体系荧光恢复；该复合物荧光探针可用于水溶液中Cys的高选择性快速检测，也可用于活细胞中Cys的标记和荧光成像。2.根据权利要求1所述的基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针，其特征在于：所述侧链含有双羧酸盐的聚噻吩衍生物的结构式为：其中R为氢、甲基、乙基、丙基或饱和烷基链；X为碳、氧、硫、硒或碲原子；M为正一价离子锂、钠、钾、银或铵。3.根据权利要求1所述的基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针，其特征在于：所述的金属离子为：Cu2+，Fe2+，Fe3+，Co2+，Pd2+，Eu3+，Ni2+，Hg2+，Ag+，Ca2+，Cd2+或Zn2+具有顺磁性且能够与聚噻吩侧链上的双羧酸盐基团结合，形成共轭聚合物/金属离子复合物，使共轭聚合物的荧光淬灭。4.一种权利要求1所述的基于共轭聚合物/金属离子复合物的L-半胱氨酸荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：第1步、共轭聚合物——侧链含有双羧酸盐的聚噻吩衍生物的制备以4-位上为氢、甲基、乙基、丙基或饱和烷基链的3-溴-噻吩为起始原料，依次经过醚化反应和亲核取代步骤，得到侧链功能化的单体；将功能化的单体完全溶于氯仿...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆燕，刘丽华，王晶，张强，赵琳琳，
申请(专利权)人：天津理工大学，
类型：发明
国别省市：天津,12