变异黄嘌呤脱氢酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种变异黄嘌呤脱氢酶及其应用。本发明专利技术的变异黄嘌呤脱氢酶是将野生变异黄嘌呤脱氢酶进行如下任一突变后获得的：1)在野生变异黄嘌呤脱氢酶的α亚基的D358与E359位之间插入一段长度由QDISAVCYKLSKRFE组成的15各氨基酸多肽片段；2)将野生变异黄嘌呤脱氢酶的α亚基进行F270L突变；3)将野生变异黄嘌呤脱氢酶的α亚基进行S362A突变。本发明专利技术的变异黄嘌呤脱氢酶的黄嘌呤氧化酶活性显著增强，与野生型黄嘌呤脱氢酶相比，利用空气中氧气作为电子受体，催化氧化黄嘌呤底物的活性分别增加2125倍，63倍和122倍，可降低生产成本，更加适用于工业化生产应用。

Mutant xanthine dehydrogenase and its application

The invention discloses a variant xanthine dehydrogenase and its application. The mutant xanthine dehydrogenase of the present invention is obtained by mutating the wild mutant xanthine dehydrogenase in any of the following ways: 1) inserting a 15-amino acid polypeptide fragment composed of QDISAVCYKLSKRFE between D358 and E359 sites of the wild mutant xanthine dehydrogenase alpha subunit; 2) inserting a wild mutant xanthine dehydrogenase alpha subunit F270L mutation was carried out on the basis; 3) S362A mutation was carried out on the subunit of the wild variant xanthine dehydrogenase. The xanthine oxidase activity of the mutant xanthine dehydrogenase of the invention is remarkably enhanced. Compared with the wild xanthine dehydrogenase, the activity of catalytic oxidation of xanthine substrates by oxygen in the air as electron acceptor is increased by 2125 times, 63 times and 122 times respectively, which can reduce the production cost and is more suitable for industrial production and application.

【技术实现步骤摘要】
变异黄嘌呤脱氢酶及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种变异黄嘌呤脱氢酶及其应用，尤其涉及一种通过点突变制造黄嘌呤氧化酶活增强的变异黄嘌呤脱氢酶及其在降解含次黄嘌呤和黄嘌呤样品中的应用。
技术介绍
黄嘌呤氧化酶(Xanthineoxidase，简称XOD，EC1.17.3.2)是一种包含铁硫簇、钼蝶呤辅基的黄素蛋白类氧化还原酶，它利用空气中氧气作为电子受体，催化氧化包括嘌呤、蝶啶和醛类等多种杂环分子的sp2杂化的碳原子，伴随产生过氧化氢和超氧化物自由基等活性氧类(李丽书，陈献华，邵叶波，刘璇，徐平，《黄嘌呤氧化还原酶的结构、功能和作用》)。XOD具有重要的商业应用价值，被用于生产XOD抗体和检测黄嘌呤/次黄嘌呤和酶联法检测无机磷等的临床诊断试剂盒，以及酶法生物合成病毒唑等核苷类药物和降解有机污染物等(Agarwal,A.,A.Banerjee,andU.C.Banerjee,Xanthineoxidoreductase:ajourneyfrompurinemetabolismtocardiovascularexcitation-contractioncoupling.CritRevBiotechnol,2011.31(3):264-80。孟疆辉,陈蔚梅,利用黄嘌呤氧化酶提高病毒唑转化率.武汉大学学报(自然科学版).1999.45(6):838-840)。XOD由前体蛋白黄嘌呤脱氢酶(Xanthinedehydrogenase，EC1.17.1.4，简称XDH)转变而来，两者是同一基因转录表达的产物，其中XDH是基因转录后直接产物，是活机体内的主要存在形式(Woolfolk,C.A.andJ.S.Downard,Distributionofxanthineoxidaseandxanthinedehydrogenasespecificitytypesamongbacteria.JBacteriol,1977.130(3):1175-91)。XOD与XDH均含有2个[2Fe-2S]簇中心(N端)，1个黄素腺嘌呤二核苷酸FAD中心(中间域)和一个1钼蝶呤中心(C端)，四个氧化还原中心在三维结构中几乎呈线性排列，结构区别仅在于FAD结合部位。XOD中FAD区域附近柔环阻塞了NAD+的进入，但不影响分子O2的进入，同时形成有利O2反应的氧化还原环境，造成XOD以O2为电子受体，而XDH优选NAD+(Enroth,C.，Eger,B.T.，Okamoto,K.，Nishino,T.，Nishino,T.，Pai,E.F，Crystalstructuresofbovinemilkxanthinedehydrogenaseandxanthineoxidase:structure-basedmechanismofconversion.ProcNatlAcadSciUSA,2000.97(20):10723-8)。相对于XDH利用昂贵的NAD+作为电子受体而言，可以直接利用空气中O2作为电子受体的XOD成为商业用酶的首选。目前，商品化XOD仅限于提取法生产，主要包括从牛奶奶油等动物源材料提取(Zikakis,J.P.andD.Townsend,Preparationofhighpurityxanthineoxidasefrombovinemilk.1977,UniversityofDelaware:USAPatentUS4172763)，野生阴沟肠杆菌(Nakanishi,T.andY.Machida,Methodandtestcompositionforthedeterminationofthesubstrateforxanthineoxidase.1982,KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd:Japan,USApatentUS4341868)和藤黄节杆菌(Tanigaki,N.，Furukawa,K.，Sogabe,Y.，Emi,S.，ThermostablexanthineoxidasefromArthrobacterluteus.1993,ToyoBosekiKabushikiKaisha:Japan，USApatentUS5185257)等野生微生物细胞提取。牛奶黄嘌呤氧化酶是最早获得专利并投向市场的酶，是目前市场上最主要的XOD。然而，目前生产工艺均依赖于活性前体XDH的生成和翻译后修饰转化成活性XOD的复杂过程，存在活性XOD与前体蛋白混杂与活性XOD含量低的问题，造成XOD价格高昂，限制了其应用发展(Enroth,C.,etal.,Crystalstructuresofbovinemilkxanthinedehydrogenaseandxanthineoxidase:structure-basedmechanismofconversion.ProcNatlAcadSciUSA,2000.97(20):10723-8)。本专利技术人前期研究获取了一种新的荚膜红细菌来源XDH(申请号201410764840.5；专利技术人：邢新会、王成华、张翀；专利技术名称：一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用)，并通过基因工程手段获取了更高催化活性的截断体形式变体XDH(申请号201510048275.7；专利技术人：邢新会、王成华、张翀；专利技术名称：一种黄嘌呤脱氢酶截断体及其应用)。相比于牛奶XDH经过胰蛋白酶等蛋白酶的部分酶解或者氧化形成二硫键自发转变成为XOD，但是两种处理方法均不能将荚膜红细菌XDH转变成XOD，即荚膜红细菌XDH是一种纯粹的XDH。荚膜红细菌XDH催化活性比牛奶XOD/XDH至少高5倍，而且具有更高的温度耐受性(LeimkühlerSilke,HodsonRachael,GeorgeGrahamN,RajagopalanK.V.RecombinantRhodobactercapsulatusxanthinedehydrogenase,ausefulmodelsystemforthecharacterizationofproteinvariantsleadingtoxanthinuriaIinhumans.JournalofBiologicalChemistry,2003,278(23):20802-20811)。如果能将荚膜红细菌XDH蛋白改造成可以直接转录翻译的XOD将具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种变异黄嘌呤脱氢酶及其应用。本专利技术所提供的变异黄嘌呤脱氢酶具备增强的黄嘌呤氧化酶的活性，该变异黄嘌呤脱氢酶是在由序列1所示氨基酸序列的α亚基与序列2所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型黄嘌呤脱氢酶序列中，进行人为突变后获得。所述人为突变为仅对α亚基进行突变(β亚基不进行突变)。本专利技术所提供的变异黄嘌呤脱氢酶具有由如下α亚基和β亚基构成。所述α亚基为如下(a1)-(a4)中任一：(a1)氨基酸序列为序列表中序列3所示的亚基；(a2)将序列表中序列1的第270位的丙苯氨酸(F)替换为亮氨酸(L)后得到的氨基酸序列所示的亚基；(a3)将序列表中序列1的第362位的丝氨酸(S)替换为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列所示的亚基；(a4)将(a1)-(a3)中任一氨基酸序列经过一个或几个氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，由α亚基和β亚基构成，其特征在于：所述α亚基为如下(a1)‑(a4)中任一；所述β亚基为如下(b1)或(b2)；(a1)氨基酸序列为序列表中序列3所示的亚基；(a2)将序列表中序列1的第270位的丙苯氨酸替换为亮氨酸后得到的氨基酸序列所示的亚基；(a3)将序列表中序列1的第362位的丝氨酸替换为丙氨酸后得到的氨基酸序列所示的亚基；(a4)将(a1)‑(a3)中任一氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加后得到的具有相同功能的亚基；(b1)氨基酸序列为序列表中序列2所示的亚基；(b2)将(b1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加后得到的具有相同功能的亚基。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，由α亚基和β亚基构成，其特征在于：所述α亚基为如下(a1)-(a4)中任一；所述β亚基为如下(b1)或(b2)；(a1)氨基酸序列为序列表中序列3所示的亚基；(a2)将序列表中序列1的第270位的丙苯氨酸替换为亮氨酸后得到的氨基酸序列所示的亚基；(a3)将序列表中序列1的第362位的丝氨酸替换为丙氨酸后得到的氨基酸序列所示的亚基；(a4)将(a1)-(a3)中任一氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加后得到的具有相同功能的亚基；(b1)氨基酸序列为序列表中序列2所示的亚基；(b2)将(b1)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加后得到的具有相同功能的亚基。2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-8)中任一所示DNA分子：1)序列表中序列5所示DNA分子；2)序列表中序列5的第1-3764位所示DNA分子；3)将序列表中序列4的第808-810位的ttc替换为ctg后所得序列所示DNA分子；4)将序列表中序列4的第808-810位的ttc替换为ctg后所得序列的第1-3719位所示DNA分子；5)将序列表中序列4的第1084-1086位的tct替换为gca后所得序列所示DNA分子；6)将序列表中序列4的第1084-1086位的tct替换为gca后所得序列的第1-3719位所示DNA分子；7)在严格条件下与1)-6)中任一所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；8)与1)-7)中任一所限...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢新会，王成华，张翀，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11