一种基于荧光PCR法联合检测HIV-1型及HCV的试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于荧光PCR法联合检测HIV‑1型及HCV的试剂盒及其制备方法和检测方法。本发明专利技术应用多重PCR技术和荧光PCR技术，将两者病毒的检测整合在一个试剂盒中，可单管联合检测HIV‑1型及HCV型病毒。具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点。另外，与当前市场上仅有的少数的同时检测两种病毒的产品相比，这类产品的灵敏度往往只能达到1x103IU/ml，且由于引物探针过多造成非特异性扩增，出现假阳性现象，影响特异性。而本发明专利技术的产品只需要选用2对引物及2条探针，灵敏度和特异性都明显优于现有产品。

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光PCR法联合检测HIV-1型及HCV的试剂盒及其制备方法和检测方法
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于荧光PCR法联合检测HIV-1型及HCV的试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)，即艾滋病(AIDS，获得性免疫缺陷综合征)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(lentivirus)，属逆转录病毒的一种。HIV通过破坏人体的T淋巴细胞，进而阻断细胞免疫和体液免疫过程，导致免疫系统瘫痪，从而致使各种疾病在人体内蔓延，最终导致艾滋病。由于HIV的变异极其迅速，难以生产特异性疫苗，至今无有效治疗方法，对人类健康造成极大威胁。据WHO统计，自1987年WHO宣布HIV大流行以来，HIV感染已经导致了3900万人死亡，目前为止HIV仍然是全球最大的公共卫生挑战之一，因此如何及早发现HIV病毒感染者，防止其传染给他人是艾滋病预防的一大重点方向。目前对HIV的检测方法主要是使用血清学方法，用酶联免疫吸附实验ELISA检测病人血清中的HIV抗体进行初筛，再用免疫印迹实验进行确认。但这类血清学检测方法不适合用于抗体窗口期的感染者或是HIV阳性母亲所生婴儿的检测。而核酸检测方法，其检测靶标直接针对HIV病毒，可有效补充血清学检测窗口期检测问题，因此在临床上已将HIV核酸检测作为HIV检测的一种补充。HIV根据血清学反应和核酸序列分为两个型：HIV-1型和HIV-2型。HIV-1型具有全球流行性，世界上绝大部分艾滋病患者都是感染了HIV-l型；而HIV-2型的感染者只集中在少数几个西非国家，其临床症状轻于HIV-1感染者，与HIV-1感染者相比平均寿命较长。因此HIV的筛查重点是HIV-1型。丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液/体液传播。据世界卫生组织估计，全球有1.8亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50％～80％HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20％～30％将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1％～4％发展成为肝细胞癌症。未来20年内与HCV感染相关的死亡率(肝衰竭及肝细胞癌导致的死亡)将继续增加，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。据估计，在目前全球存活的4000万HIV/AIDS患者中，约25％～33％的病例合并感染了HCV，在美国估计约有100万的居民合并感染HIV与HCV两种病毒。由于具有共同的传播途径，HIV与HCV合并感染的可能性很大，虽然异性传播HCV的危险性很低，但是感染HIV之后HCV感染的几率明显提高，同时感染HIV也能够增加同性传播感染HCV的可能性，因此，在高危性行为人群中两者合并感染的几率很大。基于此，对于HIV和HCV的同时检测需求也越来越显得迫切。
技术实现思路
针对传统检测手段中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于荧光PCR法联合检测HIV-1型及HCV的试剂盒及其制备方法和检测方法，可用于单管同步检测HIV-1型及HCV病毒。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种基于荧光PCR法联合检测HIV-1型及HCV的试剂盒，所述试剂盒中包括HIV-1检测引物及探针、HCV检测引物及探针。一种实施方式中，所述HIV-1检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物。一种实施方式中，HIV-1检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。一种实施方式中，HIV-1检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。一种实施方式中，HIV-1检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。一种实施方式中，HIV-1检测探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。一种实施方式中，所述HCV检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物。一种实施方式中，HCV检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。一种实施方式中，HCV检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。一种实施方式中，HIV-1检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。一种实施方式中，HCV检测探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。本专利技术的试剂盒采用多重荧光PCR技术在单管中同时进行HIV-1和HCV的检测，根据扩增及检测情况可分析判断HIV-1和HCV感染情况。因此，引物及探针的设计是本专利技术试剂盒的关键。基于本专利技术所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：RT-PCR酶、无菌水(ddH2O)等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。所述PCR反应体系中，引物、探针、RT-PCR酶、无菌水(ddH2O)均为常见组分，其含量亦为常规。所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以含有RT-PCR酶、无菌水(ddH2O)。加入本专利技术的引物及探针、待检样本即可获得PCR反应体系。所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为HIV-1型标准品和HCV标准品。所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为PCR反应缓冲液、无菌水(ddH2O)、生理盐水等。本专利技术的第二方面，提供了前述基于荧光PCR法联合检测HIV-1型及HCV的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取样品基因组DNA；(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述HIV-1检测引物及探针、HCV检测引物及探针；(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；(4)PCR反应结束后，分析结果。步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。一种实施方式中，步骤(2)中，各反应管中，PCR反应体系的体积为25ul，含样品基因组DNA5ul，多重荧光PCR检测混合液18ul，RT-PCR酶1.0ul，内部对照品1ul。优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。本专利技术的第三方面，提供了前述试剂盒在制备HIV-1型及HCV联合检测产品中的用途。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：与当前市场上单独检测HIV-1型或HCV型产品相比，本专利技术应用多重PCR技术和荧光PCR技术，将两者病毒的检测整合在一个试剂盒中，可单管联合检测HIV-1型及HCV型病毒。具有快速、特异性、灵敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光PCR法联合检测HIV‑1型及HCV的试剂盒，所述试剂盒中包括HIV‑1检测引物及探针、HCV检测引物及探针。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光PCR法联合检测HIV-1型及HCV的试剂盒，所述试剂盒中包括HIV-1检测引物及探针、HCV检测引物及探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HIV-1检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的下游引物，HIV-1检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HCV检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的下游引物，HCV检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，HIV-1检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；HCV检测探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，HIV-1检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；HIV-1检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：(...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，樊彦，熊磊，李婷婷，
申请(专利权)人：张鹏，上海之江生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31