一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物、试剂盒及方法，本发明专利技术的引物是落在慢病毒的包膜上，不需要荧光标签即可对滴度进行检测。另外，本发明专利技术检测的是感染了细胞并且成功整合的病毒，能体现出病毒的真实感染活力，且不受细胞基因组DNA提取效率影响，具有操作简便、灵敏度高的特点。

A real-time fluorescent quantitative PCR primer, kit and method for detecting lentivirus titer

The invention discloses a real-time fluorescence quantitative PCR primer, a reagent kit and a method for detecting the titer of lentivirus. The primer of the invention falls on the envelope of lentivirus, and the titer can be detected without fluorescence label. In addition, the invention detects viruses infected with cells and successfully integrated, which can reflect the true infective activity of viruses, and is not affected by the extraction efficiency of cell genomic DNA, and has the characteristics of simple operation and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及慢病毒病毒滴度检测
，具体涉及一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物、试剂盒和方法。
技术介绍
慢病毒(Lentiviralvector，LVs)是在HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)病毒基础上改造而成的病毒载体系统，区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，能高效的将目的基因(或RNAi)导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒的基因组是两条相同的正链RNA，感染细胞后在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白，或产生RNAi干扰。表达载体和辅助包装质粒共转染细胞，在细胞中完成病毒的包装。包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，也可以经过浓缩纯化后应用在体内的实验中。当携带目的基因的病毒基因组进入到宿主细胞之后，经过反转录再整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。目前，对慢病毒的滴度检测主要采用荧光滴度法、Elisa法和RT-qPCR法。荧光滴度法是使用病毒液感染细胞后，通过流式细胞仪检测样本中被成功感染的细胞的比例，能准确反映出病毒滴度以及病毒的实际感染活力。但荧光滴度法只适用于包含荧光标签的病毒，不能测定无荧光标签的病毒，因此限制了该方法的使用。Elisa法是利用抗体对慢病毒衣壳上的P24蛋白的免疫反应检测病毒滴度，其原理在于慢病毒衣壳上的P24蛋白与P24抗体包被的微孔板结合，再加入HRP标记的P24蛋白抗体，最终形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入TMB显色并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的P24蛋白呈正相关。因此，用酶标仪测定450nm波长下吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中P24蛋白浓度，从而推出慢病毒的滴度。但是，游离的P24蛋白与失去活力的病毒颗粒上的P24蛋白都能与抗体反应从而影响结果，因此不能准确测定病毒的滴度。RT-qPCR方法中，RNA的效率会影响最终结果，并且RT-qPCR法会把含有核酸但是丧失感染活性的病毒颗粒的核酸也计算在内，不能反映病毒的真实感染活力，病毒的滴度检测结果不准，因此也限制了该方法的应用。病毒产品在使用前需要测定其滴度，因此建立一套针对慢病毒的特异、快捷、敏感、有效的分子检测方法，可为慢病毒的应用提供了技术支持。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一对检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物；本专利技术的另一目的在于提供一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR试剂盒本专利技术的再一目的在于提供一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物，其核苷酸序列如下：ENV-F:CGCAGTTAATCCTGGCCTGTTA；ENV-R:ATCCTTTGATGCACACAATAGAGG。一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有上述的引物。一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞计数记录为B，稀释病毒，并将病毒转导到细胞中；2)病毒转导45～52小时后，收集细胞的基因组DNA；3)以提取得到的基因组DNA作为模板，用上述的引物ENV-F、ENV-R进行病毒基因组荧光定量PCR扩增反应和内参引物BMP2-F、BMP2-R进行靶细胞内参基因荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物，根据CT值在标准曲线中得知样品的病毒基因组拷贝数Y1、内参BMP2拷贝数Y2；4)根据公式计算出样品的滴度；滴度TU/mL＝B×2000×Y1/Y2，B为病毒转导前的细胞个数，Y1为样品的病毒基因组拷贝数、Y2为样品的内参BMP2拷贝数。进一步的，步骤1)中病毒稀释倍数为90～110倍。进一步的，步骤2)中使用聚凝胺促进病毒转导。进一步的，步骤3)内参引物BMP2-F、BMP2-R的核苷酸序列为：BMP2-F:TAGGGTAGACAGAGCCAAGG；BMP2-R:AGCACAGGACAAGAAAGTCATTG。进一步的，步骤3)中的荧光定量PCR扩增反应体系为：病毒基因组扩增反应体系为：靶细胞内参基因扩增反应体系为：进一步的，步骤3)的荧光定量PCR扩增反应程序为：95～98℃预变性1～2分钟；93～98℃变性10～30秒，55～65℃退火延伸1～3分钟，循环30～40次。本专利技术的有益效果是：本专利技术使用的实时荧光定量PCR法，其引物设计在慢病毒的包膜上，荧光标签的有无对滴度检测无影响。另外，实时荧光定量PCR法检测到的是感染了细胞并且成功整合的病毒，能体现出病毒的真实感染活力，且不受细胞基因组DNA提取效率影响。附图说明图1为慢病毒ENV的标准曲线，其中横坐标表示目的病毒片段ENV的拷贝数，纵坐标表示CT值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数；图2为内参BMP2的标准曲线，其中横坐标表示内参片段的拷贝数，纵坐标表示CT值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。图3是分别以病毒感染的细胞基因组、ENV标准品为模板进行定量PCR扩增的溶解曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1特异性引物的设计本专利技术根据公开发表的病毒序列，选取了慢病毒的包膜区域进行了引物的设计；对所设计的引物进行初步的筛选，获得一组通用性高、灵敏度和特异性较好的引物对，其核苷酸序列如下：ENV-F:CGCAGTTAATCCTGGCCTGTTA(SEQ.ID:NO.1)；ENV-R:ATCCTTTGATGCACACAATAGAGG(SEQ.ID:NO.2)。以慢病毒穿梭质粒作模板，扩增序列为：cgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggat(SEQ.ID:NO.3)；扩增片段长度为144bp。内参BMP2(Homosapiensbonemorphogeneticprotein2，骨形态发生蛋白2)引物：BMP2-F:TAGGGTAGACAGAGCCAAGG(SEQ.ID:NO.4)；BMP2-R:AGCACAGGACAAGAAAGTCATTG(SEQ.ID:NO.5)。以人来源的细胞提取的基因组DNA为模板，扩增序列为：tagggtagacagagccaagggcagagttttcagagatagtattgaaaaatcaaagcccagggccccaaagtctttctaatttatagttgatctgggcctggtttggaagattttgaatcccaatctaatccccgtgggagatcaatactacaatcaatcttattgtttccacaatgactttcttgtcctgtgct(SEQ.ID:NO.6)；扩增片段长度为194bp。实施例2标准品的制备及实时定量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物，其核苷酸序列如下：ENV‑F:CGCAGTTAATCCTGGCCTGTTA；ENV‑R:ATCCTTTGATGCACACAATAGAGG。

【技术特征摘要】
1.一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR引物，其核苷酸序列如下：ENV-F:CGCAGTTAATCCTGGCCTGTTA；ENV-R:ATCCTTTGATGCACACAATAGAGG。2.一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有权利要求1所述的引物。3.一种检测慢病毒病毒滴度的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞计数记录为B，稀释病毒，并将病毒转导到细胞中；2)病毒转导45～52小时后，收集细胞的基因组DNA；3)以提取得到的基因组DNA作为模板，用权利要求1所述的引物ENV-F、ENV-R进行病毒基因组荧光定量PCR扩增反应和内参引物BMP2-F、BMP2-R进行靶细胞内参基因荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物，根据CT值在标准曲线中得知样品的病毒基因组拷贝数Y1、内参BMP2拷贝数Y2；4)根据公式计算出样品的滴度；滴度TU/mL＝B×2...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝田，施金秀，陈银娜，
申请(专利权)人：云舟生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44