一种组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用，其中组合型仿生层析介质以亲水性多孔微球为层析基质，采用烯丙基溴活化，N‑溴代丁二酰亚胺溴代醇化，然后偶联组合型配基。组合型配基的序列为苯丙氨酸‑酪氨酸‑谷氨酸‑5‑氨基苯并咪唑。该组合型仿生层析介质同时具有苯丙氨酸‑酪氨酸‑谷氨酸三肽和氨基苯并咪唑两种功能基团，在保留多肽配基对抗体选择性高的特点上，引入疏水电荷诱导配基，使得洗脱条件更加温和，能实现有效地抗体分离。

A combination type ligand and combined biomimetic chromatography medium and its preparation method and Application

The invention relates to a combined ligand, combined biomimetic chromatography medium and its preparation method and application, wherein the combined biomimetic chromatography medium takes hydrophilic porous microspheres as the chromatography matrix, uses allyl bromide activation, N_bromosuccinimide bromination alcoholization, and then couples the combined ligand. The sequence of the combined ligand is phenylalanine tyrosine glutamic acid 5 - amino benzimidazole. The combined biomimetic chromatographic medium has two functional groups, phenylalanine tyrosine glutamate tripeptide and aminobenzimidazole. The hydrophobic charge-induced ligand is introduced to retain the high selectivity of the peptide ligand to the antibody. The elution conditions are more mild and the effective antibody separation can be achieved.

【技术实现步骤摘要】
一种组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用
本专利技术涉及仿生层析领域，具体涉及一种组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用。
技术介绍
抗体的靶向性强、生物相容性高，具有开发成治疗癌症等药物的极大潜力。随着抗体工程地不断发展，上游抗体表达和制备规模不断提高，开发高效的下游分离纯化技术是抗体产业发展的关键。目前蛋白A亲和层析是最为常用的抗体捕获方法，具有很高的选择性，但是介质价格昂贵，洗脱条件苛刻，且存在配基脱落的风险。因此，开发替代技术成为当前的热点，短肽仿生层析和疏水电荷诱导层析(Hydrophobicchargeinductionchromatography,HCIC)是其中重要的两种。短肽仿生层析是以短肽化合物作为配基的一种新型仿生亲和层析方法，短肽配基基于目标蛋白而设计，具有较高的选择性、稳定性和生物相容性好。美国专利(US7408030B2)公开了六肽配基HWRGWV，用于血清、腹水、细胞培养液和牛奶等料液中分离抗体。但是，配基中带有电荷的精氨酸会对血清白蛋白产生吸附，降低配基的选择性，只有在较高盐浓度或者添加辛酸钠时才能得到纯度较高的IgG(J.Chromatogr.A,1218:1691-1700,2011)。随着计算机分子模拟技术的引入，加速了多肽配基的筛选和优化设计。基于蛋白A亲和模型，中国专利技术专利(CN103014880A)公开了八肽配基FYWHCLDE，体现出良好的IgG分离性能。不过，相关机理研究发现IgG结合主要依靠静电相互作用，需要通过添加NaCl进行洗脱(J.Chromatogr.A,1359:100-111,2014)。基于蛋白A的Fc片段结合位点的分子模拟，中国专利技术专利(CN104645949A)公开了四肽配基YFRH，具有较高的IgG吸附容量和耐盐特性，洗脱条件温和。但是，该配基中也存在带电的精氨酸，在pH大于4的条件下对血清白蛋白的吸附量也较大，影响了介质对IgG的选择性(Biochem.Eng.J.,114:191–201,2016)。因此，多肽配基还需要进一步优化设计，既保持良好的IgG结合选择性，又需要具有温和的洗脱条件。HCIC由Burton和Harding提出(J.Chromatogr.A,71:81,1998)，配基兼具疏水和离子化基团，中性pH条件下通过疏水作用结合蛋白，调节溶液pH使得蛋白和配基间产生静电排斥作用，从而实现洗脱。美国专利(US5652348B2,US7144743B2)描述了HCIC介质的制备方法，指出在低盐和高盐条件下均能实现蛋白的有效结合。已报道的HCIC配基包括吲哚化合物(CN101036877A)、咪唑化合物(CN101185882A)、咪唑和苯组成的化合物(CN101185881A)等，具有较强的耐盐吸附特性，洗脱条件也较温和。中国专利技术专利(CN104096544A)报道了一种用于抗体分离的HCIC介质，以氨基苯并咪唑为功能配基，具有较高的抗体结合能力和非盐依赖吸附性能。但是，HCIC配基也存在一些缺陷，配基结构较单一，对抗体的选择性不高，对于不同来源的抗体，需要大量的过程优化，从复杂料液中分离得到高纯度的抗体较为困难。综上所述，短肽仿生层析和HCIC各有优缺点。中国专利技术专利(CN104117345A)提出了色氨酸和氨基苯并咪唑组成的双功能基团介质，在保留氨基苯并咪唑的HCIC特点的同时，引入色氨酸后，在一定程度上提高了对抗体的选择性，不过效果比较有限，血清白蛋白仍会部分吸附(J.Chromatogr.A,258:264,2016)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种组合型配基，同时具有苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酸三肽和氨基苯并咪唑两种功能基团，在保留多肽配基对抗体选择性高的特点上，引入疏水电荷诱导配基，使得洗脱条件更加温和，能实现有效地抗体分离。本专利技术所提供的技术方案为：一种组合型配基，结构式如下：本专利技术中的组合型配基包括三肽和一个杂环小分子，借助计算机分子模拟的手段，对蛋白A和抗体Fc结合位点的关键残基进行分析评估，筛选和设计三肽-杂环小分子的组合型配基，可以采用现有技术中的化学合成方法合成三肽-杂环小分子，序列为苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酸-5-氨基苯并咪唑。其中谷氨酸的羧基在pH中性条件下可解离而带负电，IgG等抗体在pH中性条件下带部分正电，从而在上样时可形成电荷吸附效应，辅助介质捕获抗体，提高吸附收率。本专利技术还提供一种组合型仿生层析介质，包括层析基质和组合型配基，所述层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球；所述组合型配基的序列为苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酸-5-氨基苯并咪唑；所述组合型配基的结构式如下：所述组合型仿生层析介质的结构式如下：本专利技术中组合型仿生层析介质的结构式中仅给出一个组合型配基基团，仅仅是示例性说明，层析基质的表面和内部孔道表面具有大量的组合型配基基团。本专利技术中层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球，结构式如下：结构式仅给出一个-OH，仅仅是示例性说明，其表面具有大量的-OH。本专利技术通过将组合型配基偶联到层析基质上得到组合型仿生层析介质，其中组合型配基同时具有苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酸三肽和氨基苯并咪唑两种功能基团，一方面通过分子模拟来模仿蛋白A配基与抗体Fc片段特异性结合的关键残基，优化设计苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酸三肽，使配基具有较高的抗体选择性；另一方面引入疏水性电荷诱导配基-5-氨基苯并咪唑，强化疏水作用，且通过调节溶液pH，利用静电排斥作用协助蛋白解离，降低洗脱难度，改善洗脱条件。作为优选，所述层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。本专利技术还提供一种如上述的组合型仿生层析介质的制备方法，包括如下步骤：1)层析基质采用烯丙基溴进行活化反应，得到活化层析基质；步骤1)中反应过程如下：2)活化层析基质采用N-溴代丁二酰亚胺进行溴代醇化反应，得到溴代醇化的基质；步骤2)中反应过程如下：3)将溴代醇化的基质与组合型配基进行偶联反应，得到组合型仿生层析介质；步骤3)中反应过程如下：作为优选，所述步骤1)中活化反应包括：将层析基质、二甲基亚砜溶液、烯丙基溴和氢氧化钠混合，在摇床中水浴反应，抽滤，洗涤得到活化层析基质。进一步优选，所述步骤1)中活化反应包括：层析基质抽干后，加入0.5-1.5倍层析基质质量的18-22％(v/v)二甲基亚砜溶液、0.1-1.0倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，28-32℃水浴，140-160rpm转速摇床中反应24-48小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到活化层析基质。作为优选，所述步骤2)中溴代醇化反应包括：将活化层析基质、丙酮和N-溴代丁二酰亚胺混合，在摇床中水浴反应，抽滤，洗涤，得到溴代醇化的基质。进一步优选，所述步骤2)中溴代醇化反应包括：取活化层析基质，加入1.0-3.0倍基质质量的45-55％(v/v)丙酮和0.1-0.3倍基质质量的N-溴代丁二酰亚胺，28-32℃水浴，140-160rpm转速摇床中反应1-3小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质。作为优选，所述步骤3)中偶联反应包括：将溴代醇化的基质与组合型配基溶解于二甲亚砜中，再加入碳酸钠缓冲液混合后，在摇床中水浴反应，抽滤，洗涤，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合型配基，其特征在于，结构式如下：

【技术特征摘要】
1.组合型配基，其特征在于，结构式如下：2.组合型仿生层析介质，其特征在于，包括层析基质和组合型配基，所述层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球；所述组合型配基的序列为苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酸-5-氨基苯并咪唑；所述组合型配基的结构式如下：所述组合型仿生层析介质的结构式如下：3.根据权利要求2所述的组合型仿生层析介质，其特征在于，所述层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。4.如权利要求2或3所述的组合型仿生层析介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)层析基质采用烯丙基溴进行活化反应，得到活化层析基质；2)活化层析基质采用N-溴代丁二酰亚胺进行溴代醇化反应，得到溴代醇化的基质；3)将溴代醇化的基质与组合型配基进行偶联反应，得到组合型仿生层析介质。5.根据权利要求4所述的组合型仿生层析介质的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中活化反应包括：将层析基质、二甲基亚砜溶液、烯丙基溴和氢氧化钠混合，在摇床中水浴反应，抽滤，洗涤得到活化层析...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚善泾，林东强，张其磊，邹徐俊，卢慧丽，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33