一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法技术

本发明专利技术提供了一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法，所述的无毒株中黄曲霉不表达致病相关基因Aflrum1。该菌株无毒，不产菌核，高产孢，低致病力。基于该菌株的以上特点本发明专利技术还公开了一种利用该菌株防治黄曲霉污染的方法。更加具体地，该方法包含，利用该黄曲霉菌株的无毒，不产菌核，高产孢，低致病力的特性，通过该菌株与野生产毒黄曲霉菌株在花生主产区等黄曲霉易感区域争夺有限的生态位，有效降低野生产毒黄曲霉菌株的密度，从而有效控制和降低作物受到的黄曲霉毒素的污染，及其引发的曲霉病感染。

【技术实现步骤摘要】
一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法
本专利技术属于微生物学领域，具体涉及一株不产黄曲霉毒素菌株的构建及防治黄曲霉污染的方法。
技术介绍
黄曲霉（Aspergillusflavus）是一种重要的植物病原真菌，广泛分布于自然界。黄曲霉也是一种人畜共患病原菌，可寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并产生黄曲霉毒素，其中以黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）的危害最大，是迄今为止发现的致癌性最强、毒性最强的天然污染物之一。据联合国粮食及农业组织（FOA）报告，全球每年大约25%的农作物受到真菌和真菌毒素的污染，所造成的经济损失达数千亿美元。AFB1的毒性是砒霜的68倍，氰化钾的10倍，因此对人类和动物健康造成巨大危害。在我国，花生和玉米被黄曲霉污染的情况非常普遍，畜禽饲料和水产饲料的黄曲霉污染则更为严重，结果导致黄曲霉毒素通过食物链危害人类健康。由于黄曲霉毒素含有大环共轭体系，理化性质稳定，分解温度为237~299℃，大规模工业加工、日常烹饪条件或者巴氏灭菌等都无法清除污染。因此黄曲霉污染危害极大，研究预防和控制黄曲霉污染具有重大的意义。黄曲霉产孢、产毒的能力与其生长、扩散、繁殖和毒性密切相关，影响黄曲霉的致病性。随着黄曲霉全基因组测序的完成，对其致病性相关的遗传因素筛查和研究日渐增多，然而目前发现即使完全相同遗传背景下，黄曲霉的产毒量也可能差异极大。这就提示黄曲霉对非遗传因素的影响非常敏感。这其中有关外界环境因子如营养、温度、水活度、pH值、氧化状态以及群体感性等影响黄曲霉形态和产毒的研究已开展多年，而关于体内非遗传因素调控黄曲霉致病性研究则仍处在起步阶段。黄曲霉的生长、繁殖、侵染和次级代谢，在分子水平上是错综复杂的过程，涉及许许多多的转录因子对各类基因表达的调控。研究发现黄曲霉中各类转录因子在其生命代谢活动中起到非常重要的通，尤其是在黄曲霉分生孢子的形成、次级代谢产物的生物合成以及黄曲霉对宿主的侵染过程中，各类转录调控因子发挥了非常重要的作用，因而深入研究转录因子如何调控这些基本的生命代谢活动，将为科学合理地防治黄曲霉提供更好的思路。黄曲霉中还未见关于Rum1转录因子的研究报道，故而Rum1对黄曲霉的致病性是否有影响也是未知的。本专利技术人经过广泛研究，首次在黄曲霉中发现一种黄曲霉致病相关基因，本专利技术人将之命名为Aflrum1基因。因此，本专利技术公开了一种黄曲霉不产毒株⊿Aflrum1菌株，该不产毒株中黄曲霉不表达致病相关基因Aflrum1。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种不产黄曲霉毒素菌株，菌株中Aflrum1基因基本上不表达。在一个具体的实施方式中，所述的不产黄曲霉毒素菌株：(1)Aflrum1基因片段缺失；(2)相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株产生的孢子数量显著上升；(3)相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株不产菌核。(4)相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株未检测到黄曲霉毒素；(5)相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株中产毒相关基因的表达显著下降；(6)所述的产毒相关基因包括：aflR基因、aflS基因、aflA基因，aflB基因，aflC基因、aflD基因、aflE基因、aflF基因、aflG基因、aflH基因、aflI基因、aflJ基因、aflK基因、aflL基因、aflM基因、aflN基因、aflO基因、aflP基因和aflQ基因。(7)相对于野生型黄曲霉，所述的不产黄曲霉毒素菌株侵染宿主的能力下降；(8)所述的宿主包括：粮食及其制品、豆类及其制品、坚果及其制品、植物油及其制品、调味香辛料及其制品和饲料；(9)所述的侵染宿主的能力包括：在宿主上定殖并产生菌核，以及产生黄曲霉毒素AFB1和AFB2。所述的不产黄曲霉毒素菌株通过同源重组的方法从黄曲霉菌株CA14（∆ku70,∆pyrG购自FGSC）的染色体中敲除Aflrum1基因或基因片段获得，所述的Aflrum1基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述的Aflrum1基因的表达产物AflRum1蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。所述的Aflrum1基因在防治黄曲霉污染中的应用。所述的不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株在防治黄曲霉污染中的应用。本专利技术的第二方面，提供一种基于⊿Aflrum1不产毒株防治黄曲霉污染的方法，所述方法包括：(1)利用该菌株不产黄曲霉毒素（图3），高产孢的特点，其产孢量是野生型菌株的近2倍（图2），在培养基上人工培养大量的该黄曲霉菌株的孢子；(2)将步骤(1)中获得的孢子释放到受野生黄曲霉污染的区域（包括上述的花生产区）。(3)利用⊿Aflrum1株的无毒（图2），不产菌核（图4），低致病力的特性（图4），通过步骤（2）大量该菌株的分生孢子与野生产毒黄曲霉菌株在花生主产区等黄曲霉易感区域争夺有限的生态位，有效降低野生产毒黄曲霉菌株的密度，从而有效控制和降低作物受到的黄曲霉感染，黄曲霉毒素污染及其引发的曲霉病感染。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本专利技术的优点在于：目前对黄曲霉污染的研究主要集中在黄曲霉毒素致病和产毒机理等的研究，黄曲霉毒素饲料及食品污染的检测方法改进，以及毒素污染后的处理等方面，但是对如何控制黄曲霉对作物的污染方面的研究甚少。本专利技术能有效控制和降低作物受到的产毒黄曲霉感染，有利于在污染早期从根本上解除黄曲霉毒素的产生，积累，从而有效控制黄曲霉毒素的污染。与黄曲霉毒素污染检测手段和污染后解毒技术相比，从源头上控制黄曲霉的污染，成本显著降低。因此，本研究具有潜在的巨大的经济和社会效益。附图说明图1.在黄曲霉中敲除Aflrum1基因的策略及其染色体上的酶切图谱（图1A）、Southern杂交图谱（图1B）和半定量RT-PCR检测Aflrum1敲除株Aflrum1基因的表达水平（图1C）。图2.黄曲霉⊿Aflrum1菌株和对照菌株在PDA培养基上的菌落形态（图2A、2C）和产孢数量统计（图2B、2D）。图3.黄曲霉⊿Aflrum1菌株和对照菌株在YES培养基中产生AFB1的TLC分析（图3A、3B）和产毒相关基因转录水平分析（图3C）。图4.黄曲霉⊿Aflrum1菌株和对照菌株在WKM培养基的菌落形态（图4A）和菌核数量统计（图4B）和菌核相关基因的转录水平分析（图4C）。图5.黄曲霉⊿Aflrum1菌株和对照菌株侵染花生和玉米种子5天后的形态（图5A）、产生孢子数量的统计分析（图5B）以及种子中黄曲霉毒素含量的TLC分析（图5C）。具体实施方式如本文所用，黄曲霉Aflrum1基因（SEQIDNO:1）用斜体Aflrum1表示，黄曲霉的不产毒株用⊿Aflrum1表示，或用Aflrum1缺失株表示，黄曲霉的回补菌株用⊿Aflrum1-C表示，黄曲霉的野生型菌株用WT表示。黄曲霉AflRum1蛋白（SEQIDNO:2）用正体AflRum1表示。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，所述的“含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，所述的黄曲霉菌株中不表达Aflrum1基因。

【技术特征摘要】
1.一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，所述的黄曲霉菌株中不表达Aflrum1基因。2.根据权利要求1所述的一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，所述Aflrum1基因具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；所述的基因编码的AflRum1蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的一株不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄振宏，胡育乐，汪世华，袁军，张峰，刘亚举，郭志强，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35