一种表达高酶活淀粉酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种表达高酶活淀粉酶的方法，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。本发明专利技术通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：AodevR的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第2天，AodevR敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的3倍，并且在第5天增加至参照株的7倍。

A method for expressing high enzyme active amylase

The present invention discloses a method for expressing high enzyme active amylase, which knocks the AodevR gene in Aspergillus oryzae, and then uses the strain to express amylase and obtain high enzyme active amylase. The AodevR gene in Aspergillus oryzae was replaced by the selective marker gene pyrG by homologous recombination, and the AodevR knockout strain was obtained. Then the strain was used to express the amylase, and the high enzyme active amylase could be obtained. The result of the test proved that the deletion of AodevR significantly increased the activity of Aspergillus oryzae amylase, second days, Aod The amylase activity of the evR knockout strain was 3 times that of the reference strain and increased to 7 times of that of the reference strain on the fifth day.

【技术实现步骤摘要】
一种表达高酶活淀粉酶的方法
本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种表达高酶活淀粉酶的方法。
技术介绍
淀粉是自然界最丰富的原料之一，是人类食物的重要成分，在食品领域有着广泛的用途。淀粉很容易从植物中获得，价格低廉，淀粉在工业上的应用，是缓解环境污染，实现人类可持续发展的关键。淀粉利用的关键是把淀粉降解为可发酵的糖类-葡萄糖。淀粉酶能将未经蒸煮的生淀粉直接转化成葡萄糖等可发酵性糖，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂。根据作用的方式可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中。淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生物制剂等多种领域。获得高产淀粉酶的菌株，降低淀粉酶的生产成本成为淀粉酶工业化利用的必由之路。选育优良的菌株是酶制剂产业的核心问题。用传统的菌种生产酶制剂往往存在着产量低、工艺复杂、成本高等缺点。采用工程菌高效表达酶蛋白，是降低酶制剂生产成本、创制新型酶制剂的有效途径，也是该领域的竞争焦点。发展安全、通用、高效、规模化表达系统，是全面提高酶制剂产业技术水平的战略必争之地，对于酶制剂产业实现变革性突破具有十分重要的意义。米曲霉具有卓越的表达和分泌酶蛋白的能力、安全性较高、遗传背景清晰，被认为是生产淀粉酶最有应用前景的菌株之一。构建高产淀粉酶的菌株，成为米曲霉生产淀粉酶工业化利用的途径之一。构建淀粉酶高产的菌株有用物理诱变、化学诱变、基因工程构建基因工程菌株等。用物理诱变和化学诱变的方法具有快捷有效的特点，但是诱变是一个随机的过程，缺乏方向性。基因工程构建菌株就有可操控的方向性，已经成为构建高产菌株的主要手段。基因敲除，能打破已有的代谢网络，代谢网络的改变，有利于获得更高产量的菌株。米曲霉中淀粉酶转录激活因子AmyR在淀粉或麦芽糖的诱导下会激活下游淀粉酶的表达，而CreA和CreB参与调控淀粉酶转录因子AmyR的表达。米曲霉淀粉酶生产的瓶颈在于：在米曲霉培养后期存在着反抑制调控，其会抑制米曲霉淀粉酶的生产，虽然这方面有研究通过删除单creA和双creA/creB基因片段，一定程度上提高了在高浓度培养后期的淀粉酶活性，但效果不是很明显。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种表达高酶活淀粉酶的方法，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种表达高酶活淀粉酶的方法，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。所述的表达高酶活淀粉酶的方法，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而实现AodevR敲除。所述的表达高酶活淀粉酶的方法，具体步骤如下：1)利用PrimeStarPCR聚合酶扩增AodevR基因两侧片段和pyrG基因；并电泳检测确定扩增成功；2)纯化电泳凝胶中DNA，获得AodevR基因两侧片段与pyrG基因片段；3)将AodevR基因两侧片段与pyrG基因融合，并电泳确认融合成功；4)将融合基因转化入E-F1菌株，利用选择性培养基(CD)进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，进行Southernblot鉴定；5)培养阳性菌株，获得高活性淀粉酶。步骤1)中，AodevR基因两侧片段为：AodevRL，基因序列如SEQIDNO.1所示；AodevRR，基因序列如SEQIDNO.2所示；pyrG基因的序列如SEQIDNO.3所示)。步骤1)中，PCR体系：25μL的primestarMix酶；上游引物、下游引物各2μL；1μLA.oryzaeRIB40基因组DNA；加入水至50μL；具体引物序列见下表：步骤1)中，PCR条件：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。步骤3)中，利用fusionPCR进行融合，基因加入摩尔浓度比：AodevRL：pyrG：AodevRR＝1:3:1。步骤3)中，PCR体系：primestarMix25μL；上游引物，下游引物各加2μL；按浓度比加入模板；加水定容至50μL。步骤3)中，两步法：98.0℃10s；98.0℃10s，68.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存；三步法：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃4min，35cycles；72.0℃5min；16.0℃保存。步骤4)中，转化过程如下：Solution1，使用0.45μm过滤灭菌到新的50mL灭菌tube中；将培养的米曲霉用漏斗过滤，用水冲一下把培养基冲走，用药匙挤一下把水挤下；用药匙把菌体放入1中配置的Solution0+1中，用封条裹上tube，30℃50rpm3h；制冰；过滤，取液体；加Solution210mL，上下混合；将tube取出在4℃下离心2000rpm8min，取沉淀；加5mLSolution2混匀4℃下离心2000rpm8min上清液丢弃；视沉淀量加Solution2，分装各200μL×4；分别加10μL质粒，用一次性吸管混匀；放冰上30min，在此期间将CD选择培养基放微波炉溶后，倒入50mL的tub中，放45℃中保温；30min后分3次加入Solution3：250μL混匀；250μL混匀；850μL混匀。在室温中放置20min；加入5mLSolution2混匀后4℃下离心2000rpm8min将上清液丢弃；加入500μLSolution2混匀，加入10mLCD上层培养基混匀后倒平板；在CD培养基30℃环境下3-5天避光培养。有益效果：与现有技术相比，本专利技术通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：AodevR的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第2天，AodevR敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的3倍，并且在第5天增加至参照株的7倍。附图说明图1是AodevR基因敲除原理图；图2是基因片段电泳图；图3是融合基因电泳图；图4是southernblot验证结果图；图5是米曲霉淀粉酶酶活性测定图；具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1一种表达高酶活淀粉酶的方法，流程图如图1所示，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，图中标出的SmaI酶切位点及probe探针位置用于Southernblot验证。具体步骤如下：1)利用PrimeStarPCR聚合酶(TaKaRa，Japan)扩增AodevR基因两侧片段(AodevRL，基因序列如SEQIDNO.1所示；AodevRR，基因序列如SEQIDNO.2所示)和pyrG基因(基因序列如SEQIDNO.3所示)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。

【技术特征摘要】
1.一种表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。2.根据权利要求1所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而实现AodevR敲除。3.根据权利要求1或2所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)利用PrimeStarPCR聚合酶扩增AodevR基因两侧片段和pyrG基因；并电泳检测确定扩增成功；2)纯化电泳凝胶中DNA，获得AodevR基因两侧片段与pyrG基因片段；3)将AodevR基因两侧片段与pyrG基因融合，并电泳确认融合成功；4)将融合基因转化入E-F1菌株，利用选择性培养基(CD)进行至少两次分离纯化，然后提取基因组，进行Southernblot鉴定；5)培养阳性菌株，获得高活性淀粉酶。4.根据权利要求3所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，步骤1)中，AodevR基因两侧片段为：AodevRL，基因序列如SEQIDNO.1所示；AodevRR，基因序列如SEQIDNO.2所示；pyrG基因的序列如SEQIDNO.3所示)。5.根据权利要求3所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，步骤1)中，PCR体系：25μL的primestarMix酶；上游引物、下游引物各2μL；1μLA.oryzaeRIB40基因组DNA；加入水至50μL；具体引物序列见下表：6.根据权利要求3所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，步骤1)中，PCR条件：98.0℃10s；98.0℃10s，55.0℃15s，72.0℃2min20s，35次循环；72.0℃5min；16.0℃保存。7.根据权利要求3所述的表达高酶活淀粉酶的方法，其特征在于，步骤3)中，利用fusionPCR进行融合，基因加入摩尔浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：金锋杰，庄淼，张智敏，王宝腾，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32