检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定方法技术

本公开提供了以高灵敏度和特异性检测裂解的高分子量激肽原(HMWK)和特异性结合裂解的HMWK的分离的抗体的免疫测定方法。

Immunoassay for detection of high molecular weight kinin in cleavage

The present disclosure provides a method for immunoassay of antibodies separated by high molecular weight kinin (HMWK) and specific binding cracking HMWK with high sensitivity and specificity.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测裂解的高分子量激肽原的免疫测定方法相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119要求于2015年10月19日提交的美国临时申请第62/243,505号和于2016年5月12日提交的美国临时申请第62/335,311号的权益，其每一个的全部内容通过引用纳入本文。
技术介绍
激肽原(kininogen)是激肽如缓激肽和胰激肽的前体。存在两种类型的人激肽原，即高分子量激肽原(HMWK)和低分子量激肽原(LMWK)，它们是剪接变体。HMWK主要作为凝血和炎症的辅因子，并且是用于血浆激肽释放酶(pKal)介导的缓激肽生成的优选底物。血浆激肽释放酶(pKal)是循环中主要的缓激肽生成酶。pKal的激活通过与疾病病理学相关的接触系统发生，所述疾病病理学与遗传性血管性水肿(HAE)相关。pKal裂解HMWK(单链多肽)以产生缓激肽和裂解形式的HMWK，其含有通过二硫键保持在一起的两条多肽链。Cugno等，Blood(1997)89：3213-3218。在遗传性血管性水肿(HAE)发作期间，裂解的HMWK增加至总激肽原的约47％(Cugno等，Blood(1997)89：3213-3218)，使其成为监测HAE发作的生物标志物。因此，开发敏感和可靠的测定法以检测生物样品中裂解的HMWK的水平是有意义的。
技术实现思路
本公开的一些方面提供一种用于以高灵敏度和特异性检测裂解的高分子量激肽原(HMWK)的免疫测定方法。所述方法包括：(i)提供支持构件，在所述支持构件上附接特异性结合裂解的HMWK的第一试剂(例如，诸如559B-M004-B04的抗体)；(ii)使(i)的支持构件与疑似含有裂解的HMWK的生物样品接触；(iii)使(ii)中获得的支持构件与结合HMWK的第二试剂接触，其中所述第二试剂缀合至标记物；和(iv)直接或间接检测从结合至支持构件的第二试剂的标记物释放的信号，以确定生物样品中裂解的HMWK的水平。在一些情况下，步骤(ii)可在ZnCl2的存在下进行。在一些实施方案中，在步骤(ii)之前，(i)的支持构件用封闭缓冲液培养。在一些实施方案中，所述第二试剂是多克隆抗体、单克隆抗体或结合至HMWK的两种或更多种单克隆抗体的混合物。在所述混合物中的两种或更多种单克隆抗体可结合至HMWK中的不同表位。在一些实施方案中，所述标记物是信号释放剂。在一些实施方案中，所述标记物是受体-配体对的一个成员。在此情况下，所述免疫测定方法还可包括在步骤(iv)之前，使(iii)中的固定在支持构件上的第二试剂与受体-配体对的另一成员接触，其中所述另一成员缀合至信号释放剂。在一个实例中，所述受体-配体对是生物素和链霉亲和素。本公开的另一个方面提供用于检测在样品中裂解的高分子量激肽原(HMWK)的方法，所述方法包括：(i)使疑似含有裂解的HMWK的样品与本文描述的任一种抗体(例如559B-M004-B04)接触；(ii)测量步骤(i)中形成的裂解的HMWK和抗体的复合物；和(iii)基于步骤(ii)的结果确定样品中裂解的HMWK的水平。在一些实施方案中，步骤(i)在ZnCl2的存在下进行。在一些实施方案中，步骤(i)使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)或免疫印迹测定法进行。在本文中描述的任一种方法中，所述样品可以是从受试者(例如人受试者)获得的生物样品，例如血浆样品或血清样品。在一些实施方案中，所述方法还包括将样品收集到包含一种或多种蛋白酶抑制剂的真空血液收集管中。本文中描述的任一种测定方法(例如免疫测定方法)可以是ELISA测定法、Western印迹测定法或侧向流测定法。在一些实施方案中，所述生物样品从具有疾病的受试者(例如人患者)获得。所述测定方法还可包括基于裂解的HMWK的水平确定疾病是否由血浆激肽释放酶介导，样品中裂解的HMWK的水平与对照样品裂解的HMWK的水平的偏差表示疾病由血浆激肽释放酶介导。本文中描述的任一种测定方法还可包括基于裂解的HMWK的水平鉴定具有由血浆激肽释放酶介导的疾病或紊乱的患者，或评价疾病或紊乱的治疗功效。在一些实施方案中，所述方法还可包括：如果所述受试者被鉴定为具有所述障碍，则向所述受试者施用有效量的用于治疗所述紊乱的治疗剂，例如血浆激肽释放酶(pKal)抑制剂、缓激肽2受体(B2R)抑制剂和/或C1酯酶抑制剂。在一些实施方案中，所述pKal抑制剂是抗pKal抗体。在一些实施方案中，所述治疗剂是兰达鲁单抗(lanadelumab)、艾卡拉肽(ecallantide)、艾替班特(icatibant)或人血浆衍生的C1酯酶抑制剂。在一些实施方案中，所述受试者是在接受对紊乱治疗的人患者，并且其中所述方法还包括基于步骤(iii)中确定的裂解的HMWK的水平评价所述治疗的功效，来自受试者的样品中裂解的HMWK的水平与对照样品的水平的偏差表示治疗功效。在一些实施方案中，所述方法还包括基于裂解的HMWK的水平确认受试者的合适的治疗。在一些实施方案中，所述方法还包括基于裂解的HMWK的水平将所述受试者鉴定为用于治疗所述疾病的候选者。在一些实施方案中，所述人患者具有疾病(例如HAE)的病史。在一些实施方案中，所述方法还包括基于裂解的HMWK的水平评价受试者疾病发作的风险，来自受试者的样品中裂解的HMWK的水平与对照样品的水平的偏差表示疾病发作的风险。在一些实施方案中，所述方法还包括如果所述受试者处于疾病发作的风险中，则向所述受试者施用治疗剂。在另一方面，提供用于检测裂解的高分子量激肽原(HMWK)的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合裂解的HMWK的第一试剂(例如本文中描述的抗体)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括结合HMWK的第二试剂、支持构件、或第二试剂和支持构件两者，以及任选的用于检测裂解的HMWK的说明书。在一些实施例中，所述支持构件是96孔板。在本公开的另一个方面，提供分离的抗体，其特异性结合裂解的高分子量激肽原(HMWK)。在一些实施方案中，所述抗体结合与559B-M004-B04相同的表位，或与559B-M004-B04竞争结合至裂解的HMWK。在一些实施方案中，所述抗体包括与559B-M004-B04相同的重链互补决定区和轻链互补决定区，例如与559B-M004-B04相同的重链可变区和轻链可变区。在一个实例中，所述抗体是559B-M004-B04。本文描述的对于裂解的HMWK特异的任一种抗体可被用于检测样品中的裂解的高分子量激肽原(HMWK)的方法中。这种方法可以包括：(i)使疑似含有裂解的HMWK的样品与抗体接触；(ii)测量步骤(i)中形成的裂解的HMWK和抗体的复合物；和基于步骤(ii)的结果确定样品中裂解的HMWK的水平。在一些实施方案中，所述样品是生物样品，例如由人受试者获得的血清样品或血浆样品。可依赖由该方法获得的结果以确定从其获得样品的受试者发展由血浆激肽释放酶介导的紊乱，如HAE的风险。在一些实施方案中，步骤(i)可在ZnCl2的存在下进行。本文中描述的任一个免疫测定方法可以是Western印迹形式或ELISA形式。在又一个方面，提供结合完整的高分子量激肽原(HMWK)和裂解的HMWK两者的分离的抗体。在一些实施方案中，结合完整的HMWK和裂解的HMWK两者的抗体不结合至低分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测裂解的高分子量激肽原HMWK的免疫测定方法，所述方法包括：(i)提供支持构件，在所述支持构件上固定特异性结合裂解的HMWK的第一试剂；(ii)使(i)的支持构件与疑似含有裂解的HMWK的生物样品接触；(iii)使(ii)中获得的支持构件与结合HMWK的第二试剂接触，其中所述第二试剂缀合至标记物；和(iv)直接或间接检测从结合至所述支持构件的第二试剂的标记物释放的信号，以确定所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.19 US 62/243,505;2016.05.12 US 62/335,3111.一种用于检测裂解的高分子量激肽原HMWK的免疫测定方法，所述方法包括：(i)提供支持构件，在所述支持构件上固定特异性结合裂解的HMWK的第一试剂；(ii)使(i)的支持构件与疑似含有裂解的HMWK的生物样品接触；(iii)使(ii)中获得的支持构件与结合HMWK的第二试剂接触，其中所述第二试剂缀合至标记物；和(iv)直接或间接检测从结合至所述支持构件的第二试剂的标记物释放的信号，以确定所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平。2.根据权利要求1所述的免疫测定方法，其中所述第一试剂是特异性结合所述裂解的HMWK的抗体。3.根据权利要求2所述的免疫测定方法，其中所述抗体是559B-M004-B04。4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫测定方法，其中所述支持构件是96孔板。5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫测定方法，其中在步骤(ii)之前，将所述(i)的支持构件用封闭缓冲液培养。6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫测定方法，其中所述第二试剂是多克隆抗体、单克隆抗体或结合至HMWK的两种或更多种单克隆抗体的混合物。7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫测定方法，其中所述标记物是信号释放剂。8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫测定方法，其中所述标记物是受体-配体对的一个成员，并且所述免疫测定方法还包括在步骤(iv)之前，使结合至所述支持构件的(iii)中的所述第二试剂与所述受体-配体对的另一成员接触，其中所述另一成员缀合至信号释放剂。9.根据权利要求8所述的免疫测定方法，其中所述受体-配体对是生物素和链霉亲和素。10.根据权利要求1-9中任一项所述的免疫测定方法，其中所述免疫测定方法是Western印迹测定法、ELISA测定法或侧向流测定法。11.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫测定方法，其中在ZnCl2的存在下进行步骤(ii)。12.根据权利要求1-11中任一项所述的免疫测定方法，其中所述生物样品从人受试者获得。13.根据权利要求12所述的免疫测定方法，其中所述生物样品是血清样品或血浆样品，所述血清样品或血浆样品从在包含一种或多种蛋白酶抑制剂的真空血液收集管中收集的血液样品处理。14.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，其中人受试者具有疾病，并且其中所述免疫测定方法还包括基于步骤(iv)中确定的所述裂解的HMWK的水平确定所述疾病是否由pKal介导，所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示所述疾病由pKal介导。15.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，还包括基于步骤(iv)中确定的所述裂解的HMWK的水平，确定所述人受试者是否具有由血浆激肽释放酶介导的疾病或处于血浆激肽释放酶介导的疾病的风险中，其中如果来自所述受试者的所述生物样品的所述裂解的HMWK的水平偏离对照样品的所述裂解的HMWK的水平，则所述受试者被鉴定为具有所述疾病或处于具有所述疾病的风险中。16.根据权利要求15所述的免疫测定方法，还包括如果所述受试者被鉴定为具有所述疾病，则向所述受试者施用有效量的用于治疗所述疾病的治疗剂。17.根据权利要求16所述的免疫测定方法，其中所述治疗剂为血浆激肽释放酶(pKal)抑制剂、缓激肽2受体(B2R)抑制剂和/或C1酯酶抑制剂。18.根据权利要求17所述的免疫测定方法，其中所述pKal抑制剂是抗pKal抗体或抑制肽。19.根据权利要求18所述的免疫测定方法，其中所述治疗剂是兰达鲁单抗、艾卡拉肽、艾替班特或人血浆衍生的C1-INH。20.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，其中所述人受试者在接受所述疾病的治疗，并且其中所述免疫测定方法还包括基于步骤(iv)中确定的所述裂解的HMWK的水平评价所述治疗的功效，来自所述受试者的所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示治疗功效。21.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，还包括基于所述裂解的HMWK的水平鉴定用于所述受试者的合适的治疗。22.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，还包括基于所述裂解的HMWK的水平将所述受试者鉴定为用于治疗所述疾病的候选者。23.根据权利要求12、13或15-22中任一项所述的免疫测定方法，其中所述人受试者具有所述疾病的病史。24.根据权利要求23所述的免疫测定方法，其中所述疾病是HAE。25.根据权利要求12或权利要求13所述的免疫测定方法，其中所述人受试者具有HAE的病史，并且其中所述免疫测定方法还包括基于所述裂解的HMWK的水平评价所述受试者疾病发作的风险来自所述受试者的所述生物样品中所述裂解的HMWK的水平与对照样品中所述裂解的HMWK的水平的偏差表示疾病发作的风险。26.根据权利要求25所述的方法，还包括如果所述受试者处于疾病发作的风险中，则向所述受试者施用治疗剂。27.一种分离的抗体，其特异性结合裂解的高分子量激肽原(HMWK)。28.根据权利要求27所述的分离的抗体，其中所述抗体与559B-M004-B04结合相同的表位，或与559B-M004-B04竞争结合至所述裂解的HMWK。29.根据权利要求28所述的分离的抗体，其中所述抗体包括与559B-M004-B04相同的重链互补决定区和轻链互补决定区。30.根据权利要求29所述的分离的抗体，其中所述抗体是559B-M004-B04。31.一种用于检测裂解的高分子量激肽原(HMWK)的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合裂解的HMWK的第一试剂；其中所述第一试剂是权利要求27-30中任一项所述的抗体。32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括结合HMWK的第二试剂、支持构件、或结合HMWK的第二试剂和支持构件两者。33.根据权利要求31或32所述的试剂盒，其中所述支持构件是96孔板。34.根据权利要求31-33中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于检测所述裂解的HMWK的说明书。35.一种分离的抗体，其结合完整的高分子量激肽原(HMWK)和裂解的HMWK。36.根据权利要求35所述的分离的抗体，其中所述抗体不结合至低分子量激肽原(LMWK)。37.根据权利要求36所述的分离的抗体，其中所述抗体与559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01或559B-M0004-E08结合相同的表位；或与559B-M0067-E02、559B-M0039-G07、559B-M0044-E09、559B-M0003-C08、559B-M0039-H06、559B-M0039-D08、559B-M0068-C07、559B-M0021-G11、559B-M0061-G06、559B-M0036-G12、559B-M0042-E06、559B-M0070-H10、559B-M0068-D01或559B-M0004-E08竞争结合至完整的HMWK和/或裂解的HMWK。38.根据权利要求37所述的分离的抗体，其中所述抗体包括与559B-M00...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·J·塞克斯顿，莱恩·福赛特，J·科西克，
申请(专利权)人：戴埃克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US