用于检测猪口蹄疫病毒与塞内加谷病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了用于检测用于口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒根据检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，建立了单管、同步检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的检测方法。本发明专利技术试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，可以同时进行大批量的样本分析，一次反应便能鉴别诊断样本是猪口蹄疫病毒感染，或猪塞内加谷病毒感染，或两者共同感染，为猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

Dual PCR primers, detection methods and kits for detecting swine foot and mouth disease virus and Seneca Valley virus

The invention provides a dual PCR primer, a detection method and a kit for detecting foot-and-mouth disease virus and Seneca Valley virus. The kit provides a double PCR primer for detecting the highly conservative specific sequence of the pig foot-and-mouth disease virus and the Seneca Valley virus, and established a single tube and synchronous detection method for the detection of pig foot-and-mouth disease virus and Seneca Valley virus. The kit has the characteristics of quick, simple, strong specificity, high sensitivity and good reliability, and can be used in large quantities of sample analysis at the same time. One response can identify the diagnosis samples of FMDV infection, or swine Seneca Valley virus infection, or both of them, and the pig foot-and-mouth disease virus and the Seneca valley. Monitoring, prevention and control of the virus epidemic provides strong technical support and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪口蹄疫病毒与塞内加谷病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒
本专利技术属于动物疫病检测
，具体涉及一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒。
技术介绍
口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员，为无囊膜的单股正链RNA。到目前为止，己经发现了7个血清型，80多个亚型和众多差异明显的病毒株。我国主要流行O型、A型和AsialI型。塞内加谷病毒(SenecaValleyvirus，SVV)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Senecavirus病毒属的典型代表。Hales等通过对SVV-001遗传序列进行分析后将Senecavirus列为小RNA病毒科的新的病毒属(Halesetal.,2008)，为无囊膜的单股正链RNA。SVV最初被认为是细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清(Reddyetal.,2007)。到2007年，一批自加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡，蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过PCR检测确定为SVV阳性(PasmaTetal.,2008)。2014年11月，巴西也出现猪群感染SVV的报道。2015年3月，我国广东某猪场超期断奶猪被发现跛行，出现鼻镜水泡，送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示猪口蹄疫、猪水疱病病原均阴性。继而查找资料，确定发病猪群感染SVV。随后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陆续在其他猪场发现猪群感染SVV病例。由于SVV感染动物所引起的症状与其他病毒性疾病如口蹄疫临床表现十分相似，给临床确诊带来了难度。因此，需要实验室技术加以确定。目前主要包括病毒分离、抗体检测和抗原检测等。然而这些方法操作比较繁复，且很难准确区分塞内加谷病毒感染还是口蹄疫病毒感染。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的FMDV和SVV联合检测鉴别方法，准确认别猪感染的病因并对症下药，对生猪养殖行业意义重大。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物、检测方法及试剂盒，建立一种能够同时鉴别诊断FMDV和SVV病毒的双重PCR检测方法，且具有很高检测灵敏性与特异性，能够精准的鉴别诊断出猪感染的病因，从而实施正确的治疗方案，挽回经济损失。本专利技术第一方面提供一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物，所述引物根据检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪口蹄疫病毒的检测引物，由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪塞内加谷病毒的检测引物，由SEQIDNO：5所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：6所示的核苷酸序列的反向引物组成。上述的检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物在制备检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的制品中的应用。本专利技术第二方面提供一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品制备基因组总DNA；2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR反应体系总体积为50μl，包括：1)10μM的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6所示核苷酸序列各1μl；2)10×PCRBμffer5.0μl；3)dNTPMixtμre4.0μl；4)rTaqDNA聚合酶1.0μl；5)RNasefreeddH2032.0μl；6)待测样品的DNA模板4μl。在本专利技术一实施例中，所述用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR反应条件包括：94℃预变性5min后进入循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环结束后；72℃终延伸10min。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR检测方法，其检测灵敏度可达102拷贝/μL。本专利技术第三方面提供一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR检测试剂盒，包括如本专利技术第一方面所述的检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物，还包括10×PCRbuffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、阳性质控品、阴性质控品。在本专利技术一实施例中，所述的用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR检测试剂盒可特异性检测鉴定猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒，不能检测出猪流行性腹泻病毒、猪水泡病病毒、水疱性口炎病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒中的一种或多种。本专利技术第四方面提供一种如本专利技术第一方面所述的双重PCR引物、如本专利技术第二方面所述的双重PCR检测方法或如本专利技术第三方面所述的双重PCR检测试剂盒在猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。附图说明图1为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的引物筛选电泳图，其中，M为DL1000DNAmarks，泳道1为阴性对照，泳道2为FMDV-1-F/R与SVV-1-F/R，泳道3为FMDV-1-F/R与SVV-2-F/R，泳道4为FMDV-2-F/R与SVV-2-F/R；图2为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的引物浓度优化电泳图，其中，M为DL1000DNAmarks，1为阴性对照，2-9为FMDV-1-F/R与SVV-1-F/R引物浓度组合，其中泳道7即FMDV-1-F/R与SVV-1-F/R的加入浓度均为0.2μmol/L为最优；图3为为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的退火温度优化电泳图，其中，M为DL1000DNAmarks，1为阴性对照，2-9为不同退火温度，分别为60.0℃、59.2℃、58.0℃、56.1℃、53.7℃、51.9℃、50.7℃、50.0℃；图4为本专利技术实施例提供的双重PCR检测的特异性试验的电泳图，其中泳道2为猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒混合检测的电泳结果，泳道3为猪塞内加谷病毒检测的电泳结果，泳道4为猪口蹄疫病毒检测的电泳结果，5、6、7、8、9、10分别为猪流行性腹泻病毒、猪水泡病病毒、水疱性口炎病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的电泳结果，显示未检出；图5为本专利技术实施例提供的猪塞内加谷病毒PCR检测的敏感性试验的电泳图，其中泳道2-14分别为1011-10-1拷贝/μL；图6为本专利技术实施例提供的猪口蹄疫病毒PCR检测的敏感性试验的电泳图，其中泳道2-14分别为1011-10-1拷贝/μL；图7为本专利技术实施例提供的猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒双重PCR检测的敏感性试验的电泳图，其中泳道2-14分别为1011-10-1拷贝/μL；具体实施方式以下所述是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪口蹄疫病毒的检测引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪塞内加谷病毒的检测引物，由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向引物组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物，其特征在于，所述引物根据检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的高度保守的特异性序列设计双重PCR引物，其中，猪口蹄疫病毒的检测引物，由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成，检测猪塞内加谷病毒的检测引物，由SEQIDNO：5所示的核苷酸序列的正向引物和SEQIDNO：6所示的核苷酸序列的反向引物组成。2.如权利要求1所述的检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR引物在制备检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的制品中的应用。3.一种用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR检测方法，包括以下步骤：1)从待检样品制备基因组总DNA；2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的双重PCR引物，在同一反应体系中进行双重PCR扩增，得到扩增产物；3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。4.如权利要求3所述的用于检测猪口蹄疫病毒和塞内加谷病毒的双重PCR检测方法，其特征在于，双重PCR的反应体系总体积为50μl，包括：1)10μM的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6所示核苷酸序列各1μl；2)10×PCRBμffer5.0μl；3)dNTPMixtμre4.0μl；4)rTaqDNA聚合酶1.0μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺东生，徐帅飞，苏丹萍，罗天霞，俞丽，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44