鉴定生物样品中定量细胞组成的方法技术

本发明专利技术提供了鉴定生物样品中细胞组成的定量、综合性图像的表观遗传血象，又被称为表观遗传血细胞计数，其中有利的是使用了归一化标准物。所述归一化标准物为核酸分子，其包含对待检测的每种血细胞特异的至少一种标志物区域，以及为细胞非特异的至少一种对照区域，其中所述区域以相同拷贝数存在于所述分子和/或已知组成的天然血细胞样品中。此外，本发明专利技术涉及实施生物样品的综合性定量细胞组成的表观遗传评估的试剂盒以及试剂盒的用途。所述生物样品来源于，例如哺乳动物体液，包括外周血样品、毛细管血样品或静脉血样品或其亚组分，如外周血单个核细胞或外周血单核细胞，或者组织样品，器官样品，或者来源于冷冻的、干燥的、包埋的、保存的或新鲜的体液或组织样品。

【技术实现步骤摘要】
鉴定生物样品中定量细胞组成的方法本专利技术提供了鉴定生物样品中细胞组成的定量、综合性图像的表观遗传血象，又被称为表观遗传血细胞计数，其中有利的是，使用了归一化标准物。所述归一化标准物为核酸分子，其包含对待检测的每种血细胞和/或免疫细胞特异的至少一种标志物区域以及为细胞非特异的至少一种对照区域，其中所述区域以相同拷贝数存在于所述分子和/或已知组成的天然血细胞样品中。此外，本专利技术涉及进行生物样品的综合性定量细胞组成的表观遗传评估的试剂盒以及试剂盒的用途。所述生物样品来源于，例如哺乳动物体液，包括外周血样品、毛细管血样品或静脉血样品或其亚组分，如外周血单个核细胞或外周血单核细胞，或组织样品、器官样品，或来源于冷冻的、干燥的、包埋的、保存的或新鲜的体液或组织样品。专利技术背景“血细胞计数”、“全血细胞计数”或“血细胞概况”通常指确定血细胞和/或其细胞亚群(例如，嗜中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、CD19或CD3细胞及其亚群，如CD3+CD4+和/或CD3+/CD8+细胞)的数目、比率和形态的一组测试。这样的血细胞计数在临床诊断中被用作病症的广泛筛选测试或个体一般健康状况的确定。通常，“血细胞计数”包括涉及血细胞比容、血红蛋白的定量、总血细胞和红血细胞指标(例如，平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、红血细胞分布)的测定。白血细胞(也称为白细胞)为细胞免疫系统(我们将所有免疫细胞，包括B-细胞明确定义为细胞免疫系统)的一部分，且不仅在防御哺乳动物免于外来生物体(特别是例如：病毒、细菌、寄生虫等)引起的病理效应，而且在防御哺乳动物免于来自患病的自体细胞(如肿瘤细胞)畸变中起重要作用。另外，免疫细胞自身经受疾病，作为原发性(先天性)免疫疾病如IPEX综合征，或作为继发性(获得性)免疫疾病如，例如AIDS，HIV。在前者中，免疫系统自身受损，然而，在后者中，外界因素(如病毒感染、辐射、化学疗法或环境因素)导致削弱免疫系统。存在若干类型的白细胞，它们来源于髓系-例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞-或者来源于淋巴系，包括所有淋巴细胞亚群–如，例如T-细胞、B-细胞、NK细胞。因为已经对免疫系统的成分及其细胞膜进行了许多分析，所以该正常免疫细胞计数(或比率)的失常易于被认可，被用于诊断中且可用于临床决策。因此，在临床背景中定期分析这些细胞的比率和计数–作为常规诊断工具或分析工具以及在临床研究或试验中–以便检测可由疾病或者疾病治疗或者其它内部或外部因素引起的任何异常或明显变化。例如，血细胞计数被用于诊断白细胞减少症或淋巴细胞减少症或者白细胞增多症或淋巴细胞增多症(如粒细胞增多症)的发作/出现。此外，进行血细胞计数以监测所有疾病的治疗成功，所述疾病由总体或特异性白细胞计数或淋巴细胞计数的变化导致、引起，或者所述疾病的治疗导致总体或特异性白细胞计数或淋巴细胞计数的变化。例如，针对诊断或监测感染、贫血、白血病或化学疗法的效果，使用所谓的全血细胞“分类”计数以便分析和鉴别免疫细胞及其亚群。在一些原发性免疫病症和继发性免疫病症中，该程序可为唯一可用的诊断工具。白细胞分类计数包括针对总白细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的定量的测定。通常地，对于可溶性细胞，即主要为血液还有可溶性组织或体液，这样的特异性免疫细胞概况通过流式细胞术或通过免疫组织化学(IHC，针对固体组织)来测量。两种技术都基于暴露于细胞膜上的蛋白质表位起作用，所述蛋白质表位对细胞亚群的每种亚型为特异的。最近，研究集中于白细胞亚群的生物学作用，这导致允许鉴别这种群体的临床应用及研究应用的强烈需求。技术上，在常规诊断学中，通过基于光检测和电阻抗的自动细胞计数仪来确定血细胞比容、血红蛋白以及总白细胞计数。经由血液涂片的手动显微计数或自动计数来确定白细胞分类计数，包括嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和肥大细胞。允许检测T细胞群的其它方法为MHC多度量分析、细胞因子捕获分析、个别T细胞检测(ELISPOT-测定法)或仅定性检测和定位免疫细胞(免疫组织化学分析)。如流式细胞术，这些测定基于蛋白质的检测；未使用独立于特异性表达水平的标志物。值得注意的是，所有这些测定以及基于mRNA检测的所有测定在细胞之间是不同的。这是因为即使对某种蛋白质无疑为阳性的细胞仍存在以时间方式变化量的蛋白质。因此，根据给定抗体的亲和力和非特异性结合性质以及靶蛋白的表面表达的平均量，必须确定各种和每种蛋白质标记物的“阳性”阈值。即使个体中几乎所有细胞含有完全相同的DNA密码互补/组成，高等生物体必须在不同类型的组织中利用且维持不同的基因表达模式。大多数基因调控为瞬时的，这取决于当前的细胞状态以及外界刺激的变化。另一方面，持续性调控为表观遗传学的主要作用-不会改变DNA的基本遗传密码的可遗传调控模式。DNA甲基化为表观遗传调控的典型形式；其充当细胞的稳定记忆且在维持不同细胞类型的长期身份中起重要作用。最近，发现了表观遗传调控的其它形式。除了“第五碱基”5-甲基胞嘧啶(mC)之外，可找到第六(5-羟甲基胞嘧啶，hmC)、第七(5-甲酰基胞嘧啶，fC)和第八(5-羧基胞嘧啶，cC)(MichaelJ.Booth等.QuantitativeSequencingof5-Methylcytosineand5-HydroxymethylcytosineatSingle-BaseResolutionScience,2012年5月18日,第336卷,6083期,934-937页)。所提及的DNA修饰的主要靶标为两个核苷酸序列胞嘧啶-鸟嘌呤(“CpG位点”)；在该上下文中，胞嘧啶(C)可经历简单的化学修饰以变成甲酰化的、甲基化的、羟甲基化的或羧化的。在人基因组中，除了在被称为“CpG岛”的某些相对密集簇之外，CG序列比预期更罕见。CpG岛通常与基因启动子相关，估计多于一半的人基因具有CpG岛(AntequeraandBird,ProcNatlAcadSciUSA90:11995-9,1993)。对于最近描述的一种胞嘧啶修饰，5-羟甲基化，显示了对CpG岛处的5hmC作图且定量的氧化亚硫酸氢盐测序的效用(MichaelJ.Booth等.QuantitativeSequencingof5-Methylcytosineand5-HydroxymethylcytosineatSingle-BaseResolutionScience,2012年5月18日,第336卷,6083期,934-937页)。在本专利技术的上下文中，术语“亚硫酸氢盐可转化的染色质”应意指允许亚硫酸氢盐化学修饰胞嘧啶的染色质结构(例如，充分打开的结构)。因此，术语“DNA亚硫酸氢盐可转化性”涉及使用亚硫酸氢盐处理，在所述染色质中和/或为所述染色质的一部分的各个核酸中的胞嘧啶碱基可以(或已经)被转化的程度。术语还涉及使用亚硫酸氢盐处理，在参考核酸(如质粒)中的胞嘧啶碱基可以(或已经)被转化的程度。反过来，术语“亚硫酸氢盐不可转化的染色质”或“亚硫酸氢盐不可转化的核酸”涉及使用亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶碱基不可以(或不能)被转化的程度。如上文所提及的，最近发现了三种新的本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生表观遗传血象的方法，其包括以下步骤：在表观遗传学上检测生物样品中的血细胞，以及使用归一化标准物定量所检测的所述血细胞，其中所述归一化标准物为核酸分子，其包含对待检测的每种所述血细胞特异的至少一种标志物区域，以及为细胞非特异的至少一种对照区域，其中所述区域以相同拷贝数存在于所述分子和/或已知组成的天然血细胞样品中。

【技术特征摘要】
2013.06.24 EP 13173442.8;2013.04.19 US 61/813,8021.产生表观遗传血象的方法，其包括以下步骤：在表观遗传学上检测生物样品中的血细胞，以及使用归一化标准物定量所检测的所述血细胞，其中所述归一化标准物为核酸分子，其包含对待检测的每种所述血细胞特异的至少一种标志物区域，以及为细胞非特异的至少一种对照区域，其中所述区域以相同拷贝数存在于所述分子和/或已知组成的天然血细胞样品中。2.如权利要求1所述的方法，其中所述归一化标准物为亚硫酸氢盐-未转化的或亚硫酸氢盐-转化的核酸分子。3.如权利要求2所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐-未转化的或亚硫酸氢盐-转化的核酸分子选自质粒、酵母人工染色体(YAC)、人类人工染色体(HAC)、P1-来源的人工染色体(PAC)、细菌人工染色体(BAC)和PCR-产物。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述天然血细胞样品为已知细胞组成的血样和/或已知血细胞类型和免疫细胞类型组成的血样，且优选为提前制备的。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括用测定特异性校正因子来校正所产生的所述表观遗传血象的步骤。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括基于所述检测和定量来获得综合性血象的步骤。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中检测细胞类型标志物区域，将特异性细胞类型和/或至少一种特异性细胞亚群与白细胞血象、T-淋巴细胞血象、粒细胞血象、单核细胞血象、B-淋巴细胞血象和/或NK-细胞血象的其它细胞区别开。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞非特异性对照区域选自在待检测的所有细胞中表达的基因，诸如，例如管家基因。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述归一化标准物为亚硫酸氢盐-未转化的，并且含有至少一个亚硫酸氢盐-可转化的CpG位点。10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述生物样品中的细胞类型的所述定量基于使用所述亚硫酸氢盐-未转化的归一化标准物或使用所述亚硫酸氢盐-转化的归一化标准物，将细胞类型特异性和非特异性染色质的相对量归一化。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中使用所述亚硫酸氢盐-未转化的归一化标准物的所述归一化指示所述生物样品内细胞含量的绝对量和/或百分比。12.如权利要求5至11中任一项所述的方法，其中使用所述归一化标准物，通过将所述天然血细胞样品的定量组成与所述天然血细胞样品的亚硫酸氢盐-可转化的染色质的相对量进行比较来获得每种细胞类型特异性和非特异性测定的所述测定校正因子。13.如权利要求5至11中任一项所述的方法，其中所述生物样品内细胞的相对量的所述校正通过使用所述测定校正因子获得，并且指示所述生物样品内细胞含量的绝对量和百分比。14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述生物样品为未知细胞组成的样品。15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自哺乳动物体液诸如例如外周血样品、毛细管血样品或静脉血样品或其亚组分诸如例如外周血单核细胞，血块，干血斑，组织样品，器官样品，干燥的、冷冻的、包埋的、保存的和新鲜的体液或组织样品。16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述表观遗传血象包括白细胞血象、和/或T-淋巴细胞血象、和/或粒细胞血象、和/或单核细胞血象、和/或B-淋巴细胞血象、和/或NK细胞血象。17.如权利要求16所述的方法，其中a...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯文·欧莱克，乌利齐·霍夫缪勒，
申请(专利权)人：艾皮恩蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE